Détection de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes à l’aide de l’imagerie par fluorescence

Prenez une plaque multi-puits contenant une monocouche de cellules épithéliales adhérentes sensibles à l’adhérence bactérienne.

Ajoutez un nombre variable de Pseudomonas aeruginosa marqué par des protéines fluorescentes, une bactérie pathogène, pour obtenir le rapport bactérie/cellule épithéliale souhaité.

Centrifugeuse pour rapprocher les bactéries des cellules épithéliales, facilitant ainsi les interactions.

Les pili de type IV, des fibres protéiques sur les bactéries, jouent un rôle central en se liant à des glycolipides spécifiques sur les cellules épithéliales, médiant l’adhésion bactérienne aux cellules hôtes.

Après l’incubation, laver avec un tampon pour éliminer les bactéries non adhérentes. Fixez les cellules pour préserver la structure cellulaire.

Ajoutez du DAPI, une coloration fluorescente qui se lie fortement aux régions d’ADN riches en A-T, colorant le noyau. Couvrez les cellules avec un tampon pour éviter le dessèchement des cellules.

Acquérir des images des bactéries marquées à la GFP attachées aux cellules épithéliales avec un noyau coloré au DAPI. Énumérez les bactéries adhérentes sur une seule cellule épithéliale.

L’augmentation du nombre de bactéries adhérentes par cellule hôte, en fonction de la dose, permet de quantifier les interactions hôte-pathogène.

Pour un test d’adhérence bactérienne, lavez trois fois les monocouches de cellules A549 précédemment cultivées en ajoutant 100 microlitres de PBS chaud dans chaque puits, et pipetez doucement de haut en bas. Ensuite, jetez PBS. Alternativement, après avoir ajouté PBS, attendez dix secondes, puis retirez PBS à l’aide du vide.

Pour déterminer la cinétique de l’association bactérienne, superposez les cellules avec 100 microlitres de concentrations souhaitées de suspension bactérienne avec différentes multiplicités d’infection. Faites tourner la bactérie et incubez les cellules A549 infectées à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure supplémentaire. Éliminez les bactéries non liées en lavant les monocouches cinq fois avec du PBS chaud, comme démontré.

Ensuite, fixez les cellules en ajoutant 100 microlitres de formaldéhyde à 4 % dans tous les puits d’une plaque de 96 puits sur la glace. Après 15 minutes, lavez la plaque trois fois avec du PBS pour éliminer la solution de fixation, en colorant les noyaux avec 50 nanogrammes par millilitre de coloration DAPI pendant 10 minutes à température ambiante.

Après avoir lavé les cellules avec du PBS, couvrez les cellules A549 infectées avec 100 microlitres de PBS pour éviter le dessèchement, puis conservez la plaque à 4 degrés Celsius jusqu’à deux jours dans l’obscurité ou procédez à l’imagerie.