Analyse des synapses immunitaires entre les lymphocytes T humains et les cellules Raji chargées par SEB à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 4:28 min • July 8th, 2025
Prenez des tubes de cytométrie en flux contenant des cellules de Raji déchargées et des cellules de Raji chargées d’entérotoxine B de Staphylococcus aureus ou de cellules de Raji chargées de SEB.
Ces cellules Raji chargées de SEB fonctionnent comme des lymphocytes B présentateurs d’antigène de substitution contenant le superantigène SEB complexé à des molécules du CMH de classe II.
Incuber avec des pan-leucocytes.
Les récepteurs des lymphocytes T, les TCR des lymphocytes T, se lient aux SEB des cellules Raji, qui, avec des signaux de co-stimulation, établissent une jonction cellule-cellule stable, une synapse immunitaire, conduisant à l’activation des lymphocytes T.
Cela déclenche des voies de signalisation intracellulaires, provoquant le réarrangement du cytosquelette d’actine, avec le regroupement des molécules de signalisation et des récepteurs de surface au sein de la synapse.
Après l’incubation, fixez les cellules pour préserver leurs structures cellulaires. Perméabiliser les cellules pour accéder aux cibles intracellulaires.
Ajoutez des anticorps anti-CD3 marqués au fluorophore, de la phalloïdine et du DAPI, qui se lient à CD3 dans le complexe TCR, les filaments d’actine et l’ADN, respectivement.
À l’aide d’un cytomètre en flux d’imagerie, visualisez les signaux fluorescents des CD3 et de l’actine pour déterminer leur enrichissement au niveau de la synapse en présence de SEB.
Commencez par mélanger un millilitre de sang périphérique humain fraîchement prélevé avec 30 millilitres de tampon de lyse ACK dans un tube conique de 50 millilitres. Après huit minutes à température ambiante, remplissez le tube de PBS pour un lavage par centrifugation, et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu de culture pour une incubation de 60 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, ajoutez 5 x 105 cellules d’entérotoxine B de Staphylococcus aureus ou de SEB chargées ou déchargées dans 500 microlitres de milieu de culture dans des tubes FACS individuels, suivis de 650 microlitres de pan-leucocytes. Faites tourner les co-cultures et remettez les granulés en suspension dans 150 microlitres de milieu de culture frais pour une incubation de 45 minutes à 37 degrés Celsius.
Ensuite, agitez doucement les cellules pendant 10 secondes à 100 tr/min tout en ajoutant 1,5 millilitre de paraformaldéhyde à 1,5 %. Après 10 minutes à température ambiante, arrêtez la fixation avec un millilitre de PBS complété par 1 % de BSA, et récupérez les cellules par centrifugation. Remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de PBS plus BSA et 0,1 % de saponine, et ajoutez les échantillons de cellules à deux puits individuels d’une plaque à fond en U de 96 puits.
Après 15 minutes à température ambiante, centrifugez la plaque et mettez à nouveau les pastilles en suspension dans 50 microlitres de PBS plus BSA et saponine, contenant les anticorps conjugués aux fluorophores ou les composés d’intérêt pour une incubation de 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois dans 150 microlitres de PBS plus BSA et saponine, et remettre les granulés en suspension dans 60 microlitres de PBS.
Pour imager les cellules par cytométrie en flux, ouvrez le logiciel d’analyse, vérifiez le niveau de liquide et cliquez sur Démarrer dans le menu de l’instrument. Ensuite, cliquez sur Charger et chargez les échantillons dans le port lorsque vous y êtes invité.
Sous l’onglet Éclairage, modifiez la puissance du laser d’excitation aux longueurs nanométriques appropriées. Ensuite, ajustez les portes pour les canaux 4 et 11, et ajustez la zone pour le canal 1.
Pour évaluer les réglages de la porte et de la puissance laser, basculez le menu Affichage sur la porte correspondante et ajustez les portes et les puissances laser jusqu’à ce que les cellules et les couples de cellules soient visibles. Ensuite, dans l’onglet Acquisition de fichiers, définissez le nom de l’échantillon, le nombre d’images à acquérir et la porte appropriée pour la coloration des CD3, puis cliquez sur Acquérir pour commencer l’acquisition.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant d'étudier l'activation des lymphocytes T à l'aide de cellules Raji chargées en SEB servant de cellules B présentatrices d'antigène substitutives. Le processus implique la cytométrie en flux pour visualiser la formation de la synapse immunitaire et l'engagement du récepteur des lymphocytes T.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Cytométrie en flux
Contexte
- Les cellules Raji peuvent être chargées avec des superantigènes comme SEB.
- L'activation des lymphocytes T nécessite à la fois la reconnaissance de l'antigène et des signaux de co-stimulation.
- Les synapses immunitaires sont essentielles pour des réponses efficaces des lymphocytes T.
- La cytométrie en flux permet une analyse détaillée des interactions cellulaires.
Objectif de l'étude
- Étudier les mécanismes d'activation des lymphocytes T.
- Visualiser la formation des synapses immunitaires.
- Évaluer le rôle de SEB dans l'engagement du récepteur des lymphocytes T.
Méthodes utilisées
- Préparation de cellules Raji chargées et non chargées en SEB.
- Culture mixte de cellules Raji avec des leucocytes pan.
- Fixation et perméabilisation des cellules pour la coloration par anticorps.
- Analyse par cytométrie en flux pour visualiser la dynamique du TCR et de l'actine.
Résultats principaux
- Formation réussie de synapses immunitaires entre les lymphocytes T et les cellules Raji chargées avec SEB.
- Visualisation de l'enrichissement en CD3 et en actine au niveau de la synapse.
- Mise en évidence des voies de signalisation d'activation des lymphocytes T.
- Analyse quantitative des réponses des lymphocytes T à SEB.
Conclusions
- Les cellules Raji chargées en SEB imitent efficacement les cellules présentatrices d'antigène.
- La cytométrie en flux est un outil puissant pour l'étude des interactions des lymphocytes T.
- La compréhension de la dynamique de la synapse immunologique est cruciale pour la recherche en immunologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Cette méthode permet une évaluation quantitative de la formation de la synapse immunitaire, un événement précoce essentiel dans l'activation des lymphocytes T, soutenant ainsi la validation de cibles dans la découverte d'immunomodulateurs. En visualisant l'enrichissement en CD3 et en actine par cytométrie en flux d'imagerie, elle offre une dé-risquisation mécanistique pour les produits biologiques ciblant les voies de signalisation du TCR. Cette approche renforce la fiabilité prédictive des modèles précliniques d'engagement immunitaire.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge les hypothèses relatives à la signalisation dépendante du TCR grâce à la visualisation directe de la formation de la synapse immunitaire.
- Valeur scientifique : Soutient la validation fonctionnelle des cibles en confirmant l'activation des lymphocytes T dépendante des signaux co-stimulateurs et de l'antigène.
- Valeur opérationnelle : Permet la détection biologique des risques associés à des candidats immunomodulateurs grâce à des paramètres quantitatifs de la synapse.
Élaboration de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes validés d'interaction entre lymphocytes T et CPA pour le criblage de composés en aval.
- Valeur opérationnelle : Fournit des lectures standardisées et reproductibles de la formation de la synapse pour l'optimisation des tests.
- Valeur opérationnelle : Permet une utilisation évolutive de la plateforme dans la progression de « hit » à « lead » pour les immunomodulateurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : S'aligne sur des systèmes pertinents pour les maladies en modélisant les interactions entre lymphocytes T et lymphocytes B dans des voies induites par des superantigènes.
- Valeur scientifique : Fait le lien entre la découverte et la validation préclinique grâce à la dynamique quantifiable des synapses immunitaires.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'avancement tenant compte du risque en reliant l'engagement précoce de la cible aux réponses fonctionnelles des lymphocytes T.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du criblage de l'interaction avec la cible à l'optimisation du composé candidat, en particulier pour les immunomodulateurs et les adjuvants vaccinaux.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses concernant les interactions TCR-pCMH et les interactions co-stimulatrices dans des contextes immunitaires humains.
- Écrans de sélection : Fournit des systèmes prêts à l'emploi associés à des sorties d'imagerie quantitative pour l'évaluation des effets des composés.
- Analytique : Propose des métriques d'enrichissement de la CD3 et de l'actine permettant des analyses comparatives entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en modélisant in vitro la formation de la synapse immunitaire humaine.
- Réutilisation à grande échelle : Met en place une plateforme reutilisable de cytométrie en flux par imagerie pour le profilage immunitaire dans divers domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique liée à l'activation des lymphocytes T.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité des mesures de la synapse immunitaire entre différents laboratoires.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant des indicateurs fonctionnels précoces de l'efficacité des immunomodulateurs.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats fondée sur des données quantitatives relatives à la formation de la synapse.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en immunologie, en cytométrie en flux et en protocoles de marquage fluorescent.
- Suppose l'accès à des cytomètres en flux dotés de capacités d'imagerie et à des contrôles de compensation pour les panneaux multicolores.
- Exige une standardisation de la préparation des cellules et du temps d'incubation afin d'assurer une détection reproductible des synapses.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'extension aux cellules immunitaires primaires ou aux lignées cellulaires pertinentes pour les maladies.
- Est limité par la nécessité de co-cultures cellulaires viables et de conditions optimales de chargement en SEB pour des résultats constants.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026