Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:00 min • July 8th, 2025
Prenez une plaque multipuits avec des cellules souches mésenchymateuses, ou CSM, dans des puits sélectionnés.
Introduire des macrophages et incuber, facilitant ainsi l’interaction MSC-macrophage dans les puits de co-culture.
Ajoutez du zymosan – un composant de la paroi cellulaire de la levure – conjugué à un fluorophore sensible au pH dans tous les puits.
Les récepteurs piégeurs de macrophages se lient au zymosan, déclenchant son engloutissement à l’intérieur d’un phagosome, qui fusionne avec un lysosome pour former un phagolysosome.
Un pH acide à l’intérieur du phagolysosome provoque l’émission de fluorescence par le fluorophore.
Dans les puits de co-culture, les CSM projettent des nanotubes à effet tunnel, ou TNT, des extensions cytoplasmiques qui font le pont avec les macrophages. Les mitochondries MSC traversent le TNT pour pénétrer dans les macrophages, augmentant ainsi le nombre total de mitochondries fonctionnelles.
Un nombre élevé de mitochondries augmente la production d’adénosine triphosphate ou ATP, ce qui alimente les besoins énergétiques pour une augmentation de la phagocytose.
Enregistrez l’intensité de fluorescence au fil du temps à partir des zymosans conjugués aux fluorophores internalisés.
La co-culture montre une fluorescence accrue par rapport aux puits avec uniquement des macrophages, indiquant une augmentation de la phagocytose des macrophages médiée par MSC.
Aspirez doucement le milieu des puits expérimentaux contenant des cellules souches mésenchymateuses. À l’aide d’une micropipette multicanaux, ajouter 100 microlitres de suspensions de cellules de macrophages traitées et de cellules de contrôle dans les puits expérimentaux appropriés selon la conception de la plaque, et incuber pendant la nuit comme démontré. Ajoutez un millilitre de milieu d’imagerie de cellules vivantes dans le flacon contenant un milligramme de particules de zymosan et recueillez le mélange de particules de milieu dans un tube de culture en verre.
Après avoir rincé le flacon avec un millilitre supplémentaire de solution d’imagerie, transférez le milieu d’imagerie rincé dans le tube de verre. Ensuite, ajoutez 3 millilitres de solution d’imagerie supplémentaire pour obtenir une suspension de particules de zymosan de 0,2 mg/ml. Vortex la suspension zymosan à l’aide d’impulsions rapides pendant 30 à 60 secondes. Ensuite, utilisez un sonificateur de sonde pour soniser la suspension avec 60 impulsions rapides. Après avoir aspiré le milieu, rincez les puits expérimentaux dans des puits blancs de réactif avec 100 microlitres de solution d’imagerie de cellules vivantes.
Ensuite, aspirez la solution d’imagerie de cellules vivantes des puits et ajoutez 100 microlitres de suspension zymosane. Ouvrez le plateau de plaque du lecteur fluorescent à l’aide de l’interface tactile. Placez la plaque sans le couvercle dans le bac avec le puits A1, dans le coin supérieur gauche. Fermez le plateau à l’aide de la tablette tactile et cliquez sur le bouton vert « Lire » dans le menu supérieur.