Un test pour étudier le rôle de la vitronectine dans l’adhésion bactérienne aux cellules épithéliales de l’hôte
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 3:53 min • July 8th, 2025
Prenez une plaque multi-puits contenant des monocouches de cellules épithéliales adhérentes. Remplacez le milieu par un milieu sans sérum, évitant ainsi l’interférence des protéines sériques. Après l’incubation, retirer le milieu. Lavez les cellules avec un tampon. Ajoutez un milieu réfrigéré sans sérum contenant de la vitronectine. Incuber à des températures plus basses.
Le domaine RGD N-terminal de la vitronectine se lie aux récepteurs de l’intégrine de surface des cellules épithéliales. Les températures plus basses inhibent l’internalisation cellulaire du complexe vitronectine-intégrine.
Après la saturation des récepteurs de l’intégrine, retirez le milieu. Laver avec un tampon pour éliminer l’excès de vitronectine, qui pourrait avoir un impact sur la liaison de l’intégrine dépendante de la vitronectine.
Ajouter Haemophilus influenzae de type f, ou Hif, une suspension pathogène bactérien à Gram négatif. Couver.
La protéine H à la surface de Hif se lie à l’extrémité C-terminale de la vitronectine, facilitant l’adhésion de Hif à la cellule épithéliale et l’internalisation ultérieure.
Retirez le support et lavez-le avec un tampon pour éliminer le Hif non lié. Utilisez une enzyme de détachement cellulaire pour récolter les cellules. Ajoutez un milieu contenant du sérum pour arrêter la réaction enzymatique. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de verre contenant des billes de verre. Vortex pour lyser les cellules, libérant des bactéries internalisées et attachées à la surface.
Diluez le lysat avec un milieu sans sérum et graines-graines sur une plaque de gélose au chocolat. Incuber pour que Hif forme des colonies. Comptez les colonies.
Un nombre plus élevé de colonies indique une meilleure adhérence de Hif aux cellules épithéliales en présence de vitronectine.
Cultiver des cellules épithéliales A549 comme décrit dans le protocole de texte. Après un lavage et une trypsinisation des cellules à 37 degrés Celsius, diluez la suspension cellulaire à 5 000 cellules par millilitre à l’aide d’un milieu complet contenant 5 microgrammes par millilitre de gentamicine.
Avant l’infection bactérienne, remplacez le milieu dans les puits par un milieu F12 et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius. Lavez la cellule monocouche trois fois avec 1 millilitre de PBS à température ambiante. Ensuite, placez l’assiette sur de la glace et ajoutez 200 microlitres de milieu F12 pré-réfrigéré, contenant 10 microgrammes par millilitre de vitronectine.
Après avoir incubé la plaque à 4 degrés Celsius pendant 1 heure, jetez la solution par pipetage et lavez la couche cellulaire deux fois avec 1 millilitre de PBS à température ambiante. Ajoutez 100 microlitres de Hif de type sauvage fraîchement cultivé dans un milieu F12 dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 2 heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, aspirez le milieu à l’aide d’une pipette et lavez les cellules épithéliales A549 trois fois avec du PBS à 50 microlitres par puits de solution de détachement cellulaire, puis une incubation de 5 minutes à 37 degrés Celsius.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres de milieu complet F12 par puits pour arrêter la réaction enzymatique. Transférez les cellules épithéliales de chaque puits dans un tube de verre de 6 millilitres contenant 4 billes de verre. Lyser les cellules à température ambiante en tourbillonnant pendant 2 minutes.
Après avoir dilué le lysat cellulaire 100 fois, déposer 10 microlitres de l’échantillon dilué sur une plaque de gélose au chocolat. Comptez les colonies après une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius.
Aperçu
Cette étude examine l'adhérence de Haemophilus influenzae de type f (Hif) aux cellules épithéliales, médiée par la vitronectine. Le protocole décrit les étapes de préparation de monocouches de cellules épithéliales et d'évaluation de l'adhérence bactérienne par comptage des colonies.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Biologie cellulaire
- Mécanismes d'infection
Contexte
- Haemophilus influenzae type f est un agent pathogène bactérien à gram négatif.
- La vitronectine est une glycoprotéine qui joue un rôle dans l'adhésion cellulaire.
- Les récepteurs d'intégrine sur les cellules épithéliales sont essentiels à l'adhérence bactérienne.
- La température peut influencer l'internalisation des complexes vitronectine-intégrine.
Objectif de l'étude
- Évaluer le rôle de la vitronectine dans l'augmentation de l'adhérence de Hif aux cellules épithéliales.
- Mettre en place un protocole permettant de mesurer quantitativement l'adhérence bactérienne.
- Comprendre l'interaction entre les protéines bactériennes et les récepteurs des cellules hôtes.
Méthodes utilisées
- Préparation de monocouches de cellules épithéliales dans des plaques multi-puits.
- Incubation avec la vitronectine à basse température pour prévenir l'internalisation.
- Infection des cellules par Hif et lavage ultérieur pour éliminer les bactéries non liées.
- Comptage des colonies sur des géloses au chocolat pour évaluer les niveaux d'adhérence.
Résultats principaux
- Une adhérence accrue de Hif aux cellules épithéliales a été observée en présence de vitronectine.
- La manipulation de la température a efficacement inhibé l'internalisation du complexe vitronectine-intégrine.
- Le nombre de colonies a révélé une corrélation directe entre la concentration de vitronectine et l'adhérence bactérienne.
Conclusions
- La vitronectine améliore significativement l'adhérence de Hif aux cellules épithéliales.
- La compréhension de cette interaction pourrait guider des stratégies visant à lutter contre les infections bactériennes.
- Le protocole établi peut être utilisé pour des études supplémentaires sur les mécanismes d'adhérence bactérienne.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cet essai permet une évaluation quantitative des interactions hôte-pathogène en mesurant l'adhérence bactérienne aux cellules épithéliales par des mécanismes médiés par la vitronectine. Il soutient la validation de cibles en découverte d'agents anti-infectieux en réduisant les risques associés aux hypothèses mécanistiques concernant les voies d'adhérence. La méthode offre une confiance prédictive pour prioriser les composés ou les produits biologiques qui perturbent la liaison hôte-pathogène.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Étudie l'hypothèse thérapeutique selon laquelle la vitronectine renforce l'adhésion des agents pathogènes bactériens aux cellules hôtes.
- Valeur opérationnelle : Précise le rôle des récepteurs intégrines de l'hôte dans les voies d'internalisation des agents pathogènes.
- Valeur scientifique : Soutient la validation fonctionnelle de la cible en associant la liaison vitronectine-intégrine à l'efficacité de la colonisation bactérienne.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des modèles standardisés de cellules épithéliales pour une évaluation reproductible de l'adhésion bactérienne.
- Valeur opérationnelle : Permet des lectures quantitatives en unités formant colonies pour le criblage d'inhibiteurs d'adhésion.
- Valeur scientifique : Facilite l'évolutivité du test grâce à une concentration définie de vitronectine et à des étapes d'incubation contrôlées en température.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Utilise des cellules épithéliales A549 pertinentes pour la maladie afin de modéliser les interactions avec les agents pathogènes respiratoires.
- Valeur opérationnelle : Assure une continuité allant de l'interaction avec la cible jusqu'aux résultats fonctionnels d'adhérence dans les modèles précliniques.
- Valeur scientifique : Permet une progression ajustée au risque en quantifiant la réduction de l'adhérence comme biomarqueur d'une activité anti-virulence.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, contribuant à l'identification de composés d'intérêt en mesurant les interactions pathogène-hôte médiées par la cible avant les essais d'efficacité précliniques.
- Biologie de la découverte : Teste des hypothèses mécanistiques concernant le rôle de la vitronectine dans la facilitation de l'adhérence bactérienne et de l'internalisation.
- Criblage : Fournit des données quantitatives reproductibles sur l'adhérence par comptage des UFC afin de comparer les conditions avec inhibiteurs.
- Analytique : Génère des résultats de comptage des colonies permettant des comparaisons statistiques des niveaux d'adhérence entre différents groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Relie les mécanismes moléculaires d'adhésion à une continuité préclinique en utilisant des modèles épithéliaux cliniquement pertinents.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'étude de divers pathogènes exploitant les protéines de la matrice extracellulaire de l'hôte afin de s'adhérer.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté des mécanismes d'adhésion hôte-pathogène.
- Valeur opérationnelle : Normalise l'évaluation de l'adhérence grâce à une dose définie de vitronectine, au contrôle de la température et à des étapes de lavage standardisées.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en identifiant précocement dans le processus de découverte les composés capables de bloquer l'adhérence médiée par la virulence.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des thérapeutiques anti-adhérence fondée sur des données quantitatives d'inhibition de l'adhérence.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise dans la maintenance des cultures cellulaires et la manipulation de pathogènes en conditions de biosécurité.
- Dépend de l'accès à des lecteurs de plaques multi-puits, des centrifugeuses et des incubateurs anaérobies ou au CO2 pour la croissance bactérienne.
- Nécessite une standardisation de la source et de la concentration de la vitronectine entre laboratoires pour des résultats reproductibles.
- Implique des adaptations à envisager lors de l'extension du test à d'autres types cellulaires épithéliaux ou endothéliaux non respiratoires.
- Comprend des limites pratiques telles qu'une variabilité potentielle de l'expression des facteurs de virulence bactériens, ce qui peut influencer les mesures d'adhérence.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026