Un modèle d’infection de la muqueuse cervicale humaine pour étudier la pathogenèse du VIH dans des conditions ex vivo

Placez la muqueuse utérine cervicale dans une boîte de Pétri. Séparez l’ectocervix et l’endocol muqueux de la sous-muqueuse. Coupez la couche muqueuse en explants plus petits et transférez-les dans un tube conique.

Ajoutez le virus de l’immunodéficience humaine de type 1, ou VIH-1, dans le tube d’explantation. Les particules du virus VIH-1 s’approchent de la couche muqueuse exposée et se lient au récepteur CD4 et au corécepteur CXCR4 de la cellule hôte.

Lors de la liaison, l’enveloppe virale fusionne avec la membrane de la cellule hôte, libérant une capside virale contenant de l’ARN viral et une enzyme transcriptase inverse dans le cytoplasme. À l’intérieur du cytoplasme, la transcriptase inverse convertit l’ARN viral en ADN complémentaire, ou ADNc.

L’ADNc se déplace dans le noyau de la cellule hôte, où l’intégrase incorpore l’ADN viral dans le génome de l’hôte. L’ADN viral dirige la synthèse de nouveaux ARN et protéines viraux qui s’assemblent en de nouvelles particules virales. Ces particules se détachent de la cellule hôte, acquérant une enveloppe lipidique.

Rincez les explants avec un tampon approprié pour éliminer tout virus non lié. Enfin, placez les explants sur une éponge de gélatine dans une plaque multipuits avec un milieu adapté et incuber.

L’interface air-liquide maximise l’exposition à l’oxygène et l’accessibilité des nutriments à travers les capillaires de l’éponge, améliorant ainsi la viabilité du modèle pour l’analyse en aval.

Utilisez le couvercle de la boîte de Pétri comme surface de coupe pour disséquer le tissu. En tenant doucement le tissu à l’aide d’une pince, séparez la muqueuse de l’ectocol et/ou de l’endocol de l’utérus de la sous-muqueuse stromale et sous-muqueuse à l’aide d’un scalpel et d’une lame pour obtenir des bandes de muqueuse. Coupez la muqueuse en lanières de 2 millimètres de large. Retirez et jetez autant de sous-muqueuse que possible, ne laissant qu’une couche de tissu de 2 millimètres d’épaisseur. Ensuite, coupez les bandes en blocs de 2 millimètres d’épaisseur.

Transférez les explants de tissus dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 10 à 20 millilitres de CMT pour éviter la dessiccation des tissus pendant la dissection. À la fin de la dissection, faites tourner la plaque pour randomiser la distribution de l’explant. À l’aide d’une pince stérile, transférez les explants dans des tubes coniques stériles de 1,5 millilitre. Retirez tout milieu dans le tube à l’aide d’une pipette.

Pour des résultats optimaux, les explants du col de l’utérus doivent être traités et infectés le plus tôt possible après l’opération, idéalement le jour de l’opération. Alternativement, les tissus peuvent être stockés immergés dans CMT à 4 degrés pendant la nuit et infectés immédiatement après la dissection.

Décongelez la préparation du VIH-1 dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Une fois décongelé, transférez le virus dans les tubes contenant les explants. Transférez les tubes dans un thermo-shaker et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius, en se balançant à 300 tr/min. Retournez doucement les tubes plusieurs fois toutes les 30 à 60 minutes.

Pendant ce temps, remplissez une plaque à six puits avec 3 à 4 millilitres par puits de solution saline stérile tamponnée au phosphate. À la fin de l’incubation avec le VIH-1, à l’aide d’une pipette, jeter toute préparation virale dans les tubes contenant les explants dans un récipient contenant une solution désinfectante. Ensuite, à l’aide d’une pince et d’une pipette, transférez les explants dans la plaque à six puits contenant du PBS.

Après avoir laissé reposer les explants dans du PBS pendant une minute à température ambiante, lavez-les en pipetant doucement le PBS de haut en bas dans le puits deux à trois fois. Ensuite, jetez le PBS dans un récipient avec une solution désinfectante à l’aide d’une pipette. Ajouter 3 à 4 millilitres de PBS neuf dans chaque puits. Répétez deux fois de plus pour un total de trois lavages. Jetez le PBS juste avant de transférer les explants dans les éponges pour éviter la dessiccation des tissus.

Maintenant, à l’aide d’une pince, transférez cinq à huit explants sur chaque éponge de gélatine dans une plaque à 12 puits. Remettez la plaque dans l’incubateur.