Technique de génération de particules semblables à un virus de la grippe par l’intermédiaire d’un système de mammifère

Les particules pseudo-virales, ou VLP, imitent la structure du virus mais manquent de matériel génétique viral, ce qui les rend non virulentes. Les VLP possèdent des épitopes antigéniques liés à la surface reconnus par les cellules immunitaires, ce qui en fait des candidats vaccins idéaux.

Pour générer des VLP grippaux recombinantes, prenez des vecteurs d’expression eucaryotes.

Deux vecteurs contiennent des gènes codant pour l’hémagglutinine, ou HA, et la neuraminidase, ou NA, – des protéines structurelles du virus de la grippe. Le troisième vecteur contient le gène gag, codant pour les protéines centrales du virus de l’immunodéficience humaine.

Ajouter un réactif de transfection à base de lipides cationiques. Le groupe de tête lipidique chargé positivement interagit avec l’ADN chargé négativement, formant une bicouche autour des vecteurs, générant des complexes de transfection de liposomes.

Ajoutez des complexes sur des cellules hôtes de mammifères cultivés adaptées à la production de VLP et incuberez. Les complexes de transfection pénètrent dans les cellules par endocytose - la membrane des liposomes fusionne avec la membrane de l’endosome pour libérer les vecteurs dans le cytoplasme.

Les vecteurs pénètrent dans le noyau, conduisant à l’expression des gènes viraux. Lors de la synthèse de HA et NA sur le réticulum endoplasmique, les protéines se déplacent vers la membrane plasmique via la voie sécrétoire.

Les protéines de base sont synthétisées dans le cytoplasme et transportées vers le site d’assemblage pour s’ancrer à la membrane plasmique. Les composants viraux accumulés s’auto-assemblent en VLP et bourgeonnent à partir de la cellule hôte.

Récoltez les VLP libérés pour le traitement en aval.

Le jour de la transfection, préparez des solutions de liposomes et d’ADN selon les recommandations du fabricant. Transfectez les cellules d’ADN avec une composition d’ADN de 1:1:2 de HA :NA :Gag et une quantité totale d’ADN de 40 microgrammes par fiole T-150. Répétez cette étape pour créer neuf flacons T-150 pour un volume total de 200 millilitres.

Ensuite, diluez les solutions d’ADN et de liposomes dans un milieu de transfection sans sérum et sans antibiotiques de sorte que chaque flacon contienne un volume total de 24 millilitres. Remettez les flacons dans l’incubateur et maintenez les cellules dans le milieu de culture de transfection jusqu’au jour de la récolte des particules pseudo-virales ou VLP.

Transférez le surnageant dans des tubes coniques de 15 millilitres pour récolter la culture des cellules après 72 à 96 heures après la transfection. Faites tourner les cellules vers le bas pour granuler les débris cellulaires. Collectez les surnageants et filtrez-les à travers une membrane poreuse de 0,22 micron.