Technique permettant d’établir un modèle d’infection bactérienne chez les larves d’insectes

Placez une larve de Galleria mellonella – la grande teigne de la cire – sur une plate-forme d’injection, en exposant la face ventrale.

Prenez une microseringue contenant une suspension de Mycobacterium bovis BCG lux – une souche vaccinale bactérienne vivante génétiquement modifiée pour produire de la bioluminescence. Injectez la suspension dans la dernière jambe, ou appendices abdominaux - libérant des bactéries dans l’hémolymphe - le liquide circulatoire dans la cavité corporelle.

Transférez la larve dans un environnement contrôlé et incuber. Les bactéries utilisent l’hémolymphe comme une riche source de nutriments et se multiplient.

Les hémocytes – des cellules immunitaires invertébrées de l’hémolymphe – se regroupent autour de la bactérie, formant une structure semblable à un granulome pour empêcher la propagation de l’infection. Les hémocytes libèrent de la pro-phénoloxydase, qui subit un clivage protéolytique pour former de la phénoloxydase.

La phénoloxydase synthétise la mélanine qui séquestre la bactérie au site de l’infection. Le dépôt de pigment de mélanine provoque une mélanisation systémique, assombrissant la couleur larvaire.

Les hémocytes engloutissent les bactéries dans les phagosomes. Les phagosomes fusionnent avec les lysosomes pour acquérir des enzymes lytiques, provoquant une dégradation bactérienne. Un sous-ensemble de bactéries peut échapper à la dégradation phagolysosomale et résider dans les hémocytes, entraînant une infection persistante.

Mesurez la bioluminescence bactérienne à des intervalles définis. Une baisse initiale de la bioluminescence indique une réponse antibactérienne efficace, tandis qu’un plafonnement de la valeur indique une infection persistante.

Maintenez les larves achetées dans l’obscurité à 18 degrés Celsius à leur arrivée et utilisez-les dans la semaine suivant l’achat. Identifier et sélectionner les larves saines pour l’expérimentation en fonction de la couleur crème uniforme, de la taille et du poids appropriés, de la motilité élevée et de la capacité de se redresser lorsqu’elles sont retournées. À l’aide d’une pince à épiler à bout émoussé, comptez soigneusement les larves saines dans une boîte de Pétri recouverte d’une couche de papier filtre et conservez-la à température ambiante dans l’obscurité jusqu’à utilisation.

Préparez la plate-forme d’injection en collant un papier filtre circulaire de 94 millimètres de diamètre sur une surface plane et surélevée. Aspirez trois volumes d’éthanol à 70 % dans une micro-seringue de 25 microlitres pour stériliser, jeter et rincer davantage avec trois volumes de PBST stérile. Ensuite, mettez en suspension l’inoculum BCG lux préparé et aspirez 10 microlitres dans la microseringue stérilisée. Utilisez une seringue séparée pour aspirer le PBST pour un contrôle négatif.

Après 10 injections, remettre en suspension l’inoculum BCG lux pour assurer une suspension cellulaire uniforme. À l’aide d’une pince à épiler, prélevez une larve et placez-la sur la plate-forme d’injection. Sur la plate-forme, retournez la larve sur le dos et immobilisez-la en fixant la tête et la queue à l’aide de la pince à épiler. Repérez la dernière patte gauche en comptant à partir de la tête de la larve et insérez soigneusement la pointe de l’aiguille à 5 à 6 mm de profondeur à un angle de 10 à 20 degrés par rapport au plan horizontal. Injectez l’inoculum à partir de la seringue.

Après chaque infection, transférez la larve infectée dans une boîte de Pétri recouverte d’une couche de papier filtre. Une seule boîte de Pétri de 94 millimètres peut accueillir jusqu’à 30 larves. Conservez la boîte de Pétri dans une boîte sombre ventilée à l’intérieur d’un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Surveiller la survie des larves toutes les 24 heures. Les larves sont considérées comme mortes lorsqu’elles ne bougent pas en réponse au toucher. Enregistrez la survie et évaluez la signification statistique à l’aide d’un test de Mantel-Cox.