Mesure de la charge in vivo de bactéries exprimant la luciférase chez une larve d’insecte

Pour mesurer la charge bactérienne in vivo, il faut commencer par des larves d’insectes stérilisées pré-infectées par le Bacille de Calmette-Guérin, ou BCG lux. BCG lux est une souche génétiquement modifiée de Mycobacterium bovis BCG exprimant la luciférase, une enzyme productrice de bioluminescence.

Transférez une larve d’insecte dans un tube de matrice de lyse contenant un tampon avec des billes d’acier. À l’aide d’un homogénéisateur, homogénéisez la larve en libérant les composants intracellulaires, y compris les bactéries, dans le tampon.

Centrifugez le tube pour recueillir l’homogénat et transférez-le dans un tube luminomètre.

Lavez le tube matriciel avec un tampon contenant un détergent pour solubiliser les fragments cellulaires et libérer les bactéries résiduelles.

Combinez les fractions dans le même tube de luminomètre et ajoutez le substrat de luciférase. Les substrats pénètrent dans les bactéries et interagissent avec les enzymes luciférase, ce qui entraîne une bioluminescence. Chargez le tube dans un luminomètre et mesurez la bioluminescence.

Le luminomètre mesure l’intensité de la lumière émise et calcule l’unité de lumière relative, ou RLU, indicative de la charge in vivo de BCG dans une larve d’insecte.

Étalez la suspension d’homogénat dilué sur une plaque de gélose contenant de la pipéracilline et incubez pour faire croître sélectivement le BCG en colonies distinctes. Les colonies sur la plaque représentent l’unité formant la colonie, ou UFC. Le rapport RLU/UFC corrèle la bioluminescence avec la viabilité bactérienne.

Toutes les 24 heures, sélectionnez au hasard cinq larves infectées et utilisez un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 % pour stériliser délicatement les surfaces larvaires. Placez les larves individuellement dans des tubes de matrice de lyse de deux millilitres contenant 800 microlitres de PBS stérile. Ensuite, utilisez un homogénéisateur pour homogénéiser les larves pendant 60 secondes à six mètres par seconde.

Centrifugez les tubes de lyse à 3 500 fois g pendant cinq secondes pour retirer l’homogénat des couvercles, et décantez soigneusement l’homogénat en cinq tubes de luminomètre stériles individuellement. Réservez 100 microlitres d’homogénat dans un tube de réaction stérile de 1,5 millilitre. Récupérez tout homogénat restant en lavant les tubes de matrice de lyse avec un millilitre de PBST, et pipetez dans les tubes de luminomètre correspondants.

Faites vortex les tubes du luminomètre et mesurez la bioluminescence des homogénats sur un luminomètre. Ensuite, préparez des dilutions en série de 10 fois des 100 microlitres d’homogénat réservés dans des plaques de culture à 24 puits à l’aide de PBST. Pipeter 10 microlitres de dilution sur chaque plaque de gélose Middlebrook 7H11 et utiliser un épandeur de plaque stérile pour étaler. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux semaines.

Après cela, comptez les unités formant des colonies.