Un modèle murin de poche d’air pour la collecte d’exsudat inflammatoire induit par les lipopolysaccharides

Placez une souris anesthésiée sur le coussin chirurgical stérile fixé à une unité respiratoire avec un flux continu d’oxygène et un gaz anesthésique.

À l’aide d’un filtre, chargez la seringue avec de l’air stérile. Fixez une aiguille à la seringue et injectez de l’air stérilisé par voie sous-cutanée dans le dos de la souris pour créer une poche d’air dans les couches de tissus. Surveillez la souris jusqu’à la récupération.

Anesthésie à nouveau la souris et administre du lipopolysaccharide, LPS, dans la poche d’air. Le LPS se lie au récepteur 4 de type toll, TLR-4, sur les macrophages et les cellules dendritiques résidant dans les tissus, les activant.

Les cellules activées libèrent divers médiateurs inflammatoires comme les cytokines et les chimiokines, qui attirent les neutrophiles et d’autres cellules immunitaires. Ces médiateurs augmentent également la perméabilité vasculaire des vaisseaux sanguins voisins, permettant aux cellules immunitaires et aux facteurs solubles de pénétrer dans la poche d’air à partir de la circulation sanguine.

Au fur et à mesure que le liquide s’accumule dans la poche, il forme un exsudat composé de cellules inflammatoires et de diverses molécules bioactives.

Euthanasiez la souris et injectez un tampon de lavage approprié dans la poche d’air. Recueillir l’exsudat inflammatoire dans un tube de microcentrifugation et centrifuger. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le tampon de lavage.

Analyser l’exsudat inflammatoire pour quantifier le rapport des neutrophiles et déterminer l’étendue de leur infiltration.

Après l’anesthésie des souris le jour zéro, utilisez un filtre de 0,22 micron attaché à une seringue de cinq millilitres pour obtenir un volume de trois millilitres d’air stérilisé. Soulevez la peau arrière de la souris anesthésiée à l’aide d’une pince à épiler et utilisez par voie sous-cutanée une aiguille de calibre 26 par 3/8e de pouce pour injecter trois millilitres d’air stérilisé.

Après le traitement, retirez les souris de l’unité respiratoire et placez-les dans une cage bien installée. Surveillez les souris pour vous assurer qu’elles sont en vie jusqu’à ce qu’elles commencent à se déplacer. Le troisième jour, injectez trois millilitres supplémentaires d’air stérilisé dans la poche d’air préalablement établie pour maintenir la poche d’air.

Le sixième jour, injectez différents traitements dans la poche d’air. Injectez un millilitre de PBS comme contrôle négatif, et injectez un millilitre d’un microgramme par millilitre de LPS comme contrôle positif pour induire une inflammation locale. Après six heures, sacrifiez les souris.

Pour chaque poche d’air, injectez un millilitre de tampon de lavage pour laver la poche d’air et recueillir l’exsudat inflammatoire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, lavez deux fois la poche d’air avec deux millilitres de tampon de lavage et collectez l’exsudat inflammatoire dans le même tube de centrifugation.

Centrifuger à 100 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon de lavage. Comptez les cellules pour quantifier le rapport de neutrophiles, à l’aide de l’analyseur d’hématologie automatique.