Quantification de l’infiltration de cellules immunitaires dans le tissu vésical de souris infecté par E. coli uropathogène à l’aide de la cytométrie en flux

0 vues3:43 min • July 8th, 2025

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Pour quantifier l’infiltration de cellules immunitaires dans le tissu vésical de souris infecté par E. coli uropathogène, placez le tissu haché dans un tampon de digestion contenant de la collagénase et de la désoxyribonucléase.

Incuber en secouant régulièrement pour perturber les tissus.

La collagénase digère la matrice extracellulaire du tissu, libérant des cellules. La désoxyribonucléase dégrade l’ADN libre interférent.

Après l’incubation, ajoutez un tampon avec un agent chélateur et du sérum de veau fœtal pour inactiver les enzymes digestives.

Passez le mélange digéré dans une passoire pour éliminer les débris tissulaires et le tissu conjonctif, en obtenant une suspension unicellulaire.

Centrifugez et remettez en suspension les cellules dans un tampon contenant des anticorps bloquants Fc. Ces anticorps se lient aux récepteurs Fc des cellules immunitaires pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Ajoutez des anticorps anti-CD45 marqués au fluorophore, qui se lient à la protéine CD45 transmembranaire sur les cellules immunitaires.

Centrifugez et faites passer les cellules remises en suspension dans une crépine de cellules pour éliminer les agrégats de cellules.

À l’aide d’un cytomètre en flux, mesurez les signaux de fluorescence des anticorps conjugués aux fluorophores sur les cellules immunitaires afin de quantifier l’infiltration des cellules immunitaires dans la vessie.

Pour effectuer une cytométrie en flux sur le tissu de la vessie, après avoir isolé la vessie comme démontré, utilisez des ciseaux pour bien hacher le tissu. Ajoutez 1 vessie hachée par tube contenant un tampon de digestion, puis secouez le tube pour laver le tissu haché dans le tampon de digestion et conservez-le sur de la glace jusqu’à ce que toutes les vessies soient disséquées et hachées. Incuber les vessies hachées à 37 degrés Celsius pendant 60 à 75 minutes en secouant vigoureusement à la main pendant 5 secondes toutes les 15 minutes.

Lorsque le tissu a un aspect vitreux et transparent ressemblant à du papier de soie humide, la digestion est complète. Inactivez les enzymes de digestion en ajoutant 2 à 3 millilitres de tampon de cytométrie en flux glacé et mélangez délicatement. Ensuite, placez les tubes sur de la glace.

Pour assurer une suspension unicellulaire et pour éliminer tout tissu conjonctif, passez le contenu du tube à travers un filtre de 100 micromètres placé dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, avec l’extrémité d’un piston de seringue, appuyez doucement sur tout tissu restant à travers le filtre. Lavez le filtre avec 2 millilitres supplémentaires de tampon de cytométrie en flux et conservez les échantillons sur de la glace. Ensuite, laver les échantillons par centrifugation à 200 fois g à 4 degrés Celsius pendant 7 minutes.

Remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon de cytométrie en flux contenant un bloc Fc dilué à 5 microgrammes par millilitre et transférer sur une plaque à fond rond de 96 puits. Après 10 à 15 minutes, ajoutez 100 microlitres du cocktail d’anticorps souhaité à chaque échantillon. Ensuite, incubez les échantillons sur de la glace, à l’abri de la lumière, pendant 30 à 45 minutes. Laver les échantillons par centrifugation à 200 fois g à 4 degrés Celsius pendant 7 minutes.

Enfin, remettre les pastilles cellulaires en suspension dans 200 microlitres de tampon de cytométrie en flux, et faire passer les échantillons à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres sur un tube en polystyrène de 5 millilitres juste avant l’acquisition sur un cytomètre en flux.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026