SYSTÈME DE RAPPORTEUR DE VIRUS RECOMBINANT IN VITRO POUR LA DÉTECTION D’UNE INFECTION VIRALE

Prenons une culture de cellules cancéreuses du foie humain, génétiquement modifiées pour exprimer le polypeptide de co-transport du taurocholate de sodium ou NTCP - un récepteur transmembranaire.

Ajouter le virus de l’hépatite B recombinant, ou VHB. Le virus comprend une enveloppe externe contenant des protéines de surface et une nucléocapside interne enfermant le génome. L’insertion d’un gène rapporteur de la luciférase inhibe la capacité de reproduction du virus.

La protéine d’enveloppe virale se lie au récepteur NTCP de la cellule hôte.

Le NTCP interagit avec le récepteur du facteur de croissance épidermique, l’EGFR, et s’oligomérise, induisant une endocytose du virus médiée par l’EGFR.

L’enveloppe virale fusionne avec la membrane de l’endosome pour libérer la nucléocapside, qui se désassemble au niveau du complexe de pores nucléaires.

Le génome viral pénètre dans le noyau et se convertit en ADN circulaire fermé de manière covalente ou ADNcc – un modèle stable – codant pour des protéines virales, y compris la luciférase.

À des intervalles prédéfinis, récoltez les cellules et lysez-les pour libérer la luciférase intracellulaire.

Introduisez un substrat de rapporteur. La luciférase oxyde le substrat, produisant un signal.

Une augmentation post-infection de l’activité de la luciférase indique une expression continue du génome viral.

Cellules HepG2 en plaques, exprimant de manière stable le taurocholate de sodium, polypeptide co-transporteur, ou NTCP, qui sont sensibles à l’infection par le VHB et incubent à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Un jour avant l’infection, mettez environ 5 x 10⁴ cellules HepG2/NTCP dans les puits d’une plaque recouverte de collagène à 96 puits dans 0,1 millilitre de milieu de culture. Décongelez le VPH recombinant dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius, jusqu’à ce qu’il reste un peu de glace dans le flacon.

Préparez le milieu pour l’infection en combinant 78 microlitres de milieu de culture frais, deux microlitres de DMSO, 10 microlitres de 40 % de PEG8000 dans 1X PBS et 10 microlitres de VPH recombinant. Ajouter 100 microlitres de solution recombinante de VHB dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.

Un jour après l’infection, utilisez 300 microlitres de PBS pour laver la cellule trois fois, afin d’éliminer la protéine rapporteure contaminante de la fraction virale. Ajoutez 200 microlitres de milieu de culture contenant 2 % de DMSO aux cellules infectées et incubez pendant une semaine ou moins.

Pour effectuer une analyse de l’infection par le VHB, une semaine après l’infection, utilisez le PBS pour laver les cellules infectées trois fois. Ajoutez 50 microlitres de tampon de lyse aux cellules infectées. Secouez la plaque de culture pendant cinq minutes, puis centrifugez à 2000 fois g pendant cinq minutes. Ajoutez 50 microlitres de substrat rapporteur à une plaque de luminomètre, puis ajoutez 20 microlitres de lysat cellulaire à la plaque et mélangez en secouant brièvement. Enfin, placez la plaque dans le luminomètre et lancez la lecture.