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Immunologie
0 vues • 4:33 min • July 8th, 2025
Prenez une diapositive de canal contenant des macrophages de souris. Le canal se connecte à des réservoirs remplis de médias, fournissant des nutriments aux macrophages.
Remplacez les milieux par des anticorps marqués par fluorescence, qui se lient à des glycoprotéines de surface spécifiques, marquant ainsi les macrophages.
Prenez les globules rouges humains, les globules rouges, avec des membranes cellulaires marquées par fluorescence. Opsonisez les globules rouges avec des anticorps IgG de souris, qui se lient spécifiquement à la glycophorine A.
Ajouter les globules rouges opsonisés aux IgG à la lame contenant des macrophages. Les récepteurs Fc des macrophages se lient à la région Fc des IgG sur les globules rouges, ce qui entraîne le regroupement des récepteurs Fc autour de la zone de contact et le marquage des globules rouges pour la phagocytose.
La liaison déclenche les voies de signalisation intracellulaires et active les GTPases. Les GTPases activées entraînent la réorganisation et la polymérisation de l’actine, formant de fines protubérances membranaires appelées filopodes.
De plus, les filopodes s’étendent autour du globule rouge, l’enfermant dans la cupule phagocytaire en développement. Les bords de la coupelle fusionnent, formant un phagosome qui internalise le globule rouge opsonisé pour la dégradation.
À l’aide d’un microscope confocal, obtenez des images en accéléré d’événements phagocytaires uniques.
Pour marquer les macrophages péritonéaux, remplacez le milieu bicarbonaté dans chaque lame de canal par un milieu complet complété par HEPES, et inclinez la lame pour permettre d’ajouter 100 microlitres de l’anticorps spécifique aux macrophages de souris d’intérêt marqué par fluorescence à l’ouverture du canal de 100 microlitres de la lame. Aspirez le milieu qui s’écoule dans le réservoir en aval et incubez les cellules pendant 20 minutes dans une chambre humide à 37 degrés Celsius en l’absence de dioxyde de carbone.
Pendant que les cellules péritonéales sont marquées, mélangez doucement l’échantillon de 4 à 2 000 globules rouges et transférez 400 microlitres de cellules dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2 millilitres dans un bloc d’aluminium chauffé à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire pendant environ 5 à 8 minutes.
Lorsque les cellules se sont réchauffées à 37 degrés Celsius, mélangez 0,4 microlitre d’une coloration à membrane plasma fluorescente rouge appropriée avec les cellules et replacez les cellules dans le bloc de chaleur. Après 5 minutes, lavez les cellules en ajoutant 1,6 millilitres de milieu complet frais complété par HEPES et centrifugez. Faites pivoter le tube pour identifier la pastille de globule rouge.
À l’aide d’une pointe de pipette de 1 à 1,5 millilitre, retirez soigneusement le surnageant en deux volumes sans déranger la pastille. Ensuite, mélangez 2 000 microlitres de milieu complet frais complété par HEPES avec les cellules. Centrifuger et remettre en suspension la pastille dans 400 microlitres de fluide. Ensuite, étiquetez le tube PMS pour la coloration de la membrane plasmique. À la fin de l’incubation de 20 minutes par marquage des cellules péritonéales, lavez la lame avec 1 millilitre de milieu complet frais supplémenté en HEPES.
Pour opsoniser les globules rouges, ajoutez 1 microlitre d’anticorps monoclonal anti-humain CD235a IgG2b de souris dans le tube d’échantillon PMS. Après 8 minutes à 37 degrés Celsius avec mélange une fois par minute, transférez 100 microlitres de globules rouges humains colorés par membrane plasmique, opsonisés par IgG, vers la lame de canal contenant des macrophages péritonéaux. Dès que les globules rouges humains ont été ajoutés, montez la lame sur un microscope confocal à disque rotatif avec l’incubateur de scène réglé à 37 degrés Celsius, et commencez immédiatement à imager les cellules.