Coloration à l’acétoxyméthyle de calcéine pour évaluer la cytotoxicité médiée par les cellules tueuses naturelles envers les cellules cancéreuses

Pour commencer, prenez un tube contenant des cellules cancéreuses dans un milieu sans sérum afin de minimiser l’interférence de l’estérase sérique pendant le test. Incuber avec un colorant AM à base de calcéine non fluorescent.

Les estérases intracellulaires actives hydrolysent la calcéine AM en colorant de calcéine fluorescente imperméable à la membrane retenu dans le cytoplasme.

Plaquez les cellules cancéreuses colorées à la calcéine et les cellules NK effectrices dans les puits de test, tandis que les puits de contrôle ne contiennent que des cellules cancéreuses colorées à la calcéine sans cellules NK.

Les

récepteurs activateurs de surface cellulaire des cellules NK se lient aux ligands activateurs des cellules cancéreuses, formant une synapse immunitaire. Cette liaison active la signalisation des cellules NK, polarisant les granules cytotoxiques contenant des perforines et des granzymes vers la synapse pour la libération.

Les perforines forment des pores de la membrane cellulaire cancéreuse, facilitant l’entrée cellulaire des granzymes et initiant l’apoptose. L’intégrité compromise de la membrane provoque une fuite de calcéine fluorescente, réduisant ainsi la fluorescence des cellules cancéreuses.

Capturez des images de fluorescence des puits.

Une diminution du nombre de cellules cancéreuses vivantes fluorescentes dans les puits contenant des cellules NK par rapport aux puits témoins indique une cytotoxicité médiée par les cellules NK envers les cellules cancéreuses.

Pour évaluer la cytotoxicité médiée par les cellules NK à l’aide de l’AM calcique, après avoir cultivé des cellules de la lignée cellulaire du cancer du foie humain à une confluence de 70 % à 80 %, comme démontré, réencellez les cellules dans 3 millilitres de DMEM sans sérum et étiquetez les cellules avec 1,5 microlitre de solution AM de calcium 10 millimolaires pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, récupérez les cellules par centrifugation et lavez les cellules deux fois avec 5 millilitres de PBS par lavage.

Remettre les cellules en suspension à une concentration de 1 x 10⁵ cellules par millilitre de milieu de culture et ajouter 100 microlitres de cellules à chaque puits d’une plaque de 96 puits en trois exemplaires par condition de traitement. Ensuite, ajoutez 1 x 10⁵ cellules NK humaines dans 100 microlitres de milieu de culture à chaque puits de cellules cibles, et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures.

Après la fin de l’incubation, capturez au moins 10 champs d’images différents des cellules positives pour le calcium AM pour chaque réplique de chaque condition de traitement sur un microscope à fluorescence à un grossissement de 10 fois. Ensuite, calculez le pourcentage de cytotoxicité à l’aide de la formule.