Mesure de la migration naturelle des cellules tueuses en réponse à des stimuli chimiotactiques

Commencez par ajouter des agents chimioattractants, tels qu’une chimiokine, dans une plaque multipuits.

Placez une chambre perméable transwell d’une taille de pores appropriée dans le puits. Ajoutez une suspension de cellules tueuses naturelles, ou NK, dans la chambre supérieure et incuberez.

Quelques molécules de chimiokines diffusent à travers la membrane et se lient aux récepteurs des cellules NK. Cela déclenche des voies de signalisation qui favorisent les changements cytosquelettiques, entraînant un mouvement cellulaire directionnel vers la concentration plus élevée de chimioattractant dans la chambre inférieure.

Après l’incubation, transférez un volume fixe de cellules migrées de la chambre inférieure vers un tube de tri cellulaire activé par fluorescence ou un tube FACS. Ajoutez un nombre prédéterminé de billes de comptage fluorescentes et effectuez un comptage de cellules basé sur FACS.

À l’aide de la formule suivante, déterminez le nombre absolu de cellules NK migrées dans l’échantillon.

Le graphique à points indique le nombre de billes et de cellules de comptage séparées en régions distinctes, en fonction de leurs propriétés de fluorescence et de diffusion.

Pour mesurer la migration des cellules NK en réponse à des stimuli chimiotactiques, prélevez des cellules NK humaines à partir d’une culture confluente de 70 % à 80 % et remettez les cellules en suspension à une concentration de 2,5 x 10⁶ cellules par millilitre de milieu de culture de cellules NK sans sérum. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de milieu sans sérum contenant le chimioattracteur de cellules NK d’intérêt par puits.

Et placez un insert de culture de 6,5 millimètres de diamètre avec des pores de 5 micromètres dans chaque puits de milieu. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de cellules NK dans le compartiment supérieur de chaque insert et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures.

À la fin de l’incubation, transférez tout le volume de cellules migrées non adhérentes du fond de chaque puits dans des tubes FACS individuels de 5 millilitres, et ajoutez 15 microlitres d’un nombre prédéterminé de billes de comptage par cytométrie en flux dans chaque tube. Ensuite, à l’aide d’un cytomètre en flux, évaluez chaque échantillon de cellule selon les protocoles d’analyse standard de la cytométrie en flux et calculez le nombre absolu de cellules NK migrées à l’aide de la formule.