Analyse de l’efférocytose des thymocytes apoptotiques par les macrophages péritonéaux

L’efférocytose est le processus par lequel les cellules phagocytaires éliminent les cellules apoptotiques.

Pour analyser l’efférocytose, obtenir des thymocytes de souris sensibles à l’apoptose. Incuber avec un colorant CFSE perméable aux cellules.

Les estérases intracellulaires client le CFSE au colorant fluorescent imperméable aux cellules, colorant les thymocytes. Ajoutez du sérum inactivé à la chaleur pour éviter les taches excessives.

Déposer les thymocytes colorés sur une plaque de culture. Ajoutez de la staurosporine, un inhibiteur de la protéine kinase, qui perturbe la cascade de signalisation cellulaire critique, induisant l’apoptose. De plus, les résidus de phosphatidylsérine se déplacent vers le feuillet externe de la membrane cellulaire, fonctionnant comme des « signaux mange-moi ».

Ajoutez des concentrations croissantes de thymocytes apoptotiques à des puits de plaques multipuits contenant des macrophages péritonéaux de souris activés, qui expriment des récepteurs tyrosine kinases spécifiques.

Ces kinases se lient à la phosphatidylsérine exposée sur les thymocytes apoptotiques, facilitant ainsi leur internalisation par les macrophages.

Après l’incubation, retirez les thymocytes apoptotiques flottants. Ajoutez des anticorps anti-CD11b marqués au fluorophore, qui se lient aux molécules CD11b des macrophages.

À l’aide d’un microscope à fluorescence, observez les thymocytes apoptotiques fluorescents dans des macrophages différemment fluorescents, indiquant une efférocytose.

Les puits avec des concentrations plus élevées de thymocytes apoptotiques présentent une augmentation des thymocytes internalisés.

Pour prélever des thymocytes après avoir ouvert la cavité thoracique d’une souris C57/Black-6 naïve, utilisez une pince à pointe fine incurvée pour retirer le thymus. Placez l’organe dans une boîte de culture tissulaire contenant 10 millilitres de milieu RPMI-1640. Broyez tout le thymus contre les extrémités givrées de 2 lames de microscope et filtrez la suspension tissulaire résultante à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Récupérez les thymocytes par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans 40 millilitres.

Après le comptage, centrifugez à nouveau les cellules et remettez en suspension jusqu’à 2 x 10⁸ cellules dans 20 millilitres de PBS frais par tube de 50 millilitres. Étiquetez les cellules avec 5 micromolaires CFSE dans 20 millilitres de PBS par tube. Retournez les tubes deux à trois fois pour mélanger, avant d’incuber les thymocytes pendant 2 minutes maximum à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, arrêtez la réaction avec 10 millilitres de sérum de cheval inactivé par la chaleur, et collectez les cellules par centrifugation.

Remettre en suspension les cellules marquées dans 40 millilitres de PBS frais pour le comptage et la centrifugation, suivis d’un lavage supplémentaire avec 40 millilitres de milieu. Après le lavage du milieu, remettez les thymocytes en suspension à une concentration de milieu de culture tissulaire de 7 x 10⁶ cellules par millilitre, et ensemencez les cellules dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres. Ensuite, ajoutez de la staurosporine à la culture cellulaire à une concentration finale de 1 micromolaire et placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant 4 heures.

Pour l’isolement des macrophages péritonéaux, injectez à deux souris C57/Black-6 par voie intrapéritonéale 1 millilitre de thioglycolate vieilli à 3 % au jour 0, avant d’ouvrir la peau abdominale sans perturber le péritoine au jour 5.

Pour rincer la cavité péritonéale, utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 18 pour enfoncer rapidement 10 millilitres de tampon de lavage dans la cavité avant d’aspirer lentement le tampon de lavage pour la collecte dans un tube de 50 millilitres. Lavez le gavage péritonéal deux fois avec du PBS. Remettre en suspension les macrophages péritonéaux à une concentration de milieu de culture tissulaire de 2 fois 10 à six cellules par millilitre.

Ensuite, ensemencez 500 microlitres de macrophages dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant 2 heures. À la fin de l’incubation, aspirez le surnageant pour éliminer les cellules flottantes, et ajoutez 500 microlitres de milieu de culture tissulaire dans chaque puits.

Ajouter immédiatement 0 à 12 x 10⁶ thymocytes dans 500 microlitres de milieu dans chaque puits de la culture, et placer la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 4 heures. À la fin de l’incubation, laver chaque puits deux fois avec du PBS frais pour éliminer toutes les cellules apoptotiques flottant librement, suivi d’un lavage unique avec un tampon de coloration. Ensuite, étiquetez les macrophages liés à la plaque avec 200 microlitres de tampon de coloration complété par un anticorps anti-CD11b approprié par puits, et placez la plaque à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes.