JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 3:35 min • July 8th, 2025
Prenez des souches virulentes et moins virulentes de Staphylococcus aureus.
Ajoutez du sérum pour opsoniser les bactéries.
Transférez des concentrations bactériennes croissantes dans des puits à plaques multipuits réfrigérés contenant des neutrophiles. Les basses températures empêchent l’activation des neutrophiles.
Centrifugeuse pour faciliter la phagocytose synchronisée.
Les récepteurs neutrophiles se lient aux opsonines, déclenchant l’internalisation bactérienne dans les phagosomes.
Chez les bactéries virulentes, l’environnement phagosomal déclenche l’expression des toxines cytolytiques.
Ces toxines forment des pores, perturbant les phagosomes et compromettant l’intégrité de la membrane des neutrophiles.
Cependant, les bactéries les moins virulentes présentent une expression réduite de la toxine cytolytique.
Après l’incubation, détachez les neutrophiles et transférez-les dans des tubes de cytomètre en flux contenant un colorant fluorescent à l’iodure de propidium (PI).
Le colorant pénètre dans les neutrophiles avec des membranes compromises et colore l’ADN.
À l’aide d’un cytomètre en flux, analysez les neutrophiles pour la coloration PI.
Une augmentation dépendante de la concentration de la proportion de neutrophiles PI positifs après phagocytose de la souche virulente, par rapport à la souche moins virulente, indique la cytotoxicité de la souche virulente contre les neutrophiles.
Lorsque le staphylocoque doré sous-cultivé a atteint une croissance exponentielle moyenne, transférez 1 millilitre de bactéries cultivées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et centrifugez à 5000 g pendant 5 minutes à température ambiante. Laver S. aureus en aspirant le surnageant sans perturber la pastille et remettre en suspension les bactéries granulées dans 1 millilitre de DPBS. Vortex les échantillons pendant 30 secondes. Centrifuger les échantillons à 5000 g pendant 5 minutes à température ambiante.
Pour opsoniser le staphylocoque doré, il faut d’abord remettre en suspension la pastille bactérienne dans 1 millilitre de sérum humain à 20 %. Ensuite, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius en agitant pendant 15 minutes. Staphylocoque doré opsonisé par lavage après centrifugation, comme indiqué précédemment. Souches diluées de Staph aureus opsonisées à 1 x 108 unités formant colonies, UFC par millilitre, avec RPMI glacé. Agitez l’échantillon pendant 30 secondes et placez-le sur de la glace.
Confirmez les concentrations de Staph aureus utilisées pour ces tests en plaçant 1 à 10 dilutions en série de bactéries sur de la gélose. Doucement, ajoutez 100 microlitres par puits de chaque souche de Staphylocoque aureus, ou RPMI, pour des contrôles positifs et négatifs des PMN dans une plaque de 96 puits sur glace à partir de l’étape 1.14. Rochez doucement la plaque pour répartir le staphylocoque doré dans les puits.
Synchroniser la phagocytose en centrifugeant la plaque à 500 g pendant huit minutes à 4 degrés Celsius et la plaque d’incubation à 37 degrés Celsius, immédiatement après la centrifugation au temps 0. Aux moments souhaités, placez la plaque sur de la glace et ajoutez 200 microlitres de DPBS glacé contenant 1 microlitre d’iodure de propidium dans chaque tube de cytométrie en flux, puis transférez les échantillons dans leur tube correspondant.