Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 5:26 min • July 8th, 2025
Exposer une souris à des gouttelettes d’aérosol contenant Mycobacterium tuberculosis.
Les bactéries atteignent la lumière des alvéoles – les minuscules sacs d’air à l’intérieur des poumons – contenant des macrophages.
Les récepteurs de reconnaissance des motifs des macrophages se lient aux motifs moléculaires associés aux agents pathogènes sur les bactéries, déclenchant leur engloutissement dans un phagosome.
Les bactéries englouties sécrètent des protéines spécialisées, qui rompent la membrane du phagosome. Les bactéries s’échappent dans le cytoplasme et se reproduisent.
Après l’infection, anesthésie la souris. Administrer par voie intrapéritonéale un substrat rapporteur de l’enzyme bactérienne β-lactamase pour l’imagerie par fluorescence de l’enzyme rapporteure ou REF.
Le substrat atteint les alvéoles pulmonaires par circulation et pénètre dans les cellules infectées.
Il pénètre dans la membrane externe bactérienne pour atteindre l’espace périplasmique contenant la β-lactamase.
Le substrat contient un anneau β-lactame reliant un fluorochrome et un extincteur. En raison de la proximité, la fluorescence du fluorochrome est absorbée par le quencher.
La β-lactamase hydrolyse le cycle β-lactamines, libérant le fluorophore et entraînant une émission de fluorescence.
Imager la fluorescence pour évaluer l’infection mycobactérienne.
Pour continuer, chargez les animaux de poids connu dans la chambre d’inoculation sous tension. La chambre peut accueillir jusqu’à 90 souris. Ensuite, fermez tous les loquets de la porte. Ensuite, connectez le nébuliseur à l’aide d’une pince en acier. Ensuite, appuyez sur le bouton de démarrage de la chambre et réglez le débit d’air entre 3 et 5 litres par minute.
L’air comprimé s’écoulera à environ 22 à 26 livres par pouce carré et, surtout, il devrait être possible de voir le brouillard d’inoculum dans la chambre. Après 15 minutes, un voyant rouge à l’avant du panneau de commande apparaîtra et un signal sonore indiquera la fin de la course. Ensuite, appuyez sur le bouton de réinitialisation pour réinitialiser les minuteries. Pour libérer le vide, appuyez sur le petit bouton rouge situé sur la porte de la chambre.
Ensuite, ouvrez la porte de la chambre et renvoyez les souris dans leurs cages domestiques. À l’avenir, gardez les animaux dans la salle de confinement. Ensuite, remettez le pot dans le récipient de transport dans l’enceinte de biosécurité. Là, jetez la suspension bactérienne restante dans un conteneur à déchets désigné. Ensuite, placez le bocal de nébulisation usagé dans un sac à risque biologique et scellez le sac pour le transport vers l’autoclave.
Pour nettoyer la chambre, vaporisez les surfaces intérieures avec du phénol tamponné et de l’éthanol à 70 %. Laissez ces solutions réagir sur ces surfaces pendant 10 minutes, puis essuyez-les soigneusement. Jetez toutes les lingettes à la poubelle des matières biologiques. Ensuite, autoclavez les poubelles, le conteneur à déchets et les bocaux de nébulisation usagés.
Transférez les animaux dans la salle d’imagerie. Là, anesthésie un animal selon le protocole textuel et injecte-lui un substrat de contraste par injection intrapéritonéale. Dans le logiciel du système d’imagerie, initialisez le système et procédez lorsque la barre de température devient verte. Après avoir initialisé le système, placez la souris dans la chambre d’imagerie.
Assurez-vous que ses narines sont à l’intérieur du cône nasal afin qu’il reçoive une anesthésie pendant l’imagerie. Maintenant, retournez à l’ordinateur. Dans le panneau de commande d’acquisition, sélectionnez fluorescence, transillumination pour la visualisation de l’animal entier ou épi-illumination pour visualiser les tissus pulmonaires. Pour une seule souris, réglez le champ de vision sur B et le niveau de la lampe sur élevé.
Pour l’exposition, utilisez le temps automatique, le binning moyen et deux ou trois pour le F/Stop. Ensuite, réglez le filtre d’excitation sur 745 nanomètres et les filtres d’émission sur 780 à 840 nanomètres. Ensuite, allez dans la configuration de la séquence et sélectionnez 9 à 12 points de transillumination dans la zone d’intérêt. Maintenant, appuyez sur le bouton d’acquisition pour collecter des images.