Évaluation de la virulence de Leishmania dans les macrophages en culture

Commencez avec une plaque multi-puits contenant des macrophages dérivés de la moelle osseuse sur des lamelles.

Traitez les macrophages avec Leishmania promastigotes - le stade infectieux du parasite.

Pendant l’incubation, les parasites interagissent avec les macrophages, facilitant l’assemblage de l’actine F autour du site d’interaction.

Les macrophages engloutissent les parasites dans des phagosomes entourés d’actine F, formant des vacuoles parasitophores ou PV - une niche réplicative.

Dans les PV, les parasites libèrent des facteurs de survie, augmentant l’accumulation d’actine F autour des vacuoles et inhibant leur fusion avec les lysosomes.

De plus, les parasites régulent à la hausse la production d’hepcidine – une hormone peptidique des macrophages, inhibant la libération de fer et augmentant les niveaux de fer intracellulaires.

L’afflux de fer dans les vacuoles favorise la différenciation des promastigotes en amastigotes pathogènes et facilite leur multiplication, augmentant ainsi la virulence.

Après l’incubation, laver pour éliminer les parasites libres, puis, fixer et perméabiliser les macrophages infectés.

Introduisez un colorant fluorescent d’acide nucléique pour colorer les noyaux des macrophages et des amastigotes infectés.

Au microscope à fluorescence, de petits noyaux regroupés autour du grand noyau du macrophage confirment la présence de parasites intracellulaires, démontrant la virulence de Leishmania.

Le septième ou le huitième jour après la culture, utilisez une pointe d’aspiration fixée à une conduite de vide pour transférer quatre lamelles de verre de 12 millimètres stérilisées à l’autoclave au fond de chaque puits d’une plaque de culture à six puits sans chevauchement. Préparez des plaques identiques pour chaque point temporel de l’expérience. Ensuite, lavez les cultures de macrophages dérivées de la moelle osseuse 2 fois avec du PBS frais à 37 degrés Celsius et cinq millilitres de PBS sans calcium ni magnésium, complétés par un EDTA millimolaire dans chaque plaque.

Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, regroupez les cellules détachées dans un tube conique de 50 millilitres, en rinçant chaque plaque deux fois avec cinq millilitres supplémentaires de PBS sans calcium ni magnésium. Après centrifugation, remettre les macrophages en suspension dans cinq à 10 ml de milieu de macrophages frais dérivé de la moelle osseuse sur de la glace. Après le comptage, diluez les cellules à une concentration de 5 x 10⁵ par millilitre dans un milieu de macrophages frais dérivé de la moelle osseuse et ajoutez deux millilitres de cellules par puits dans la plaque à 6 puits. Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit dans l’incubateur de culture cellulaire.

Pour infecter les cellules avec L amazonensis, diluez la suspension de parasites à la multiplicité expérimentale appropriée de l’infection, et ajoutez 50 à 100 microlitres de parasites à chaque puits de toutes les plaques à six puits, y compris tous les points temporels de l’expérience. Incuber les macrophages dérivés de la moelle osseuse pendant la période d’infection et la température appropriées.

Ensuite, lavez les puits trois fois avec deux millilitres de PBS frais à 37 degrés Celsius sans calcium ni magnésium par puits, et fixez les échantillons initiaux avec 1,5 à 2 ml de paraformaldéhyde à 2 % pendant 10 minutes. Pour les plaques correspondant aux points temporels ultérieurs, ajoutez 2 millilitres de milieu de macrophage frais dérivé de la moelle osseuse dans chaque puits et remettez les plaques dans l’incubateur approprié. Ensuite, fixez et lavez les cellules pour chaque point temporel restant comme nous venons de le démontrer, et stockez les échantillons à 4 degrés Celsius dans du PBS frais.

Pour colorer les cellules avec du DAPI, remplacez le surnageant par 1,5 ml de PBS frais sans calcium ni magnésium, complété par un détergent non ionique à 0,1 % pendant 10 minutes à température ambiante, suivi de trois lavages de 2 millilitres avec du PBS sans calcium ni magnésium. Ensuite, colorez les cellules avec deux microgrammes par millilitre de DAPI dans 1 millilitre de PBS pendant une heure à température ambiante. Après trois lavages, placez les lamelles côté cellule vers le bas sur des lames de microscope en verre individuelles montées avec un réactif de montage anti-décoloration disponible dans le commerce.

Ensuite, pour quantifier le nombre de cellules infectées, utilisez l’objectif à huile d’immersion 100x d’un microscope à fluorescence et le compteur Emanuel pour identifier le nombre de petits noyaux d’amastigote regroupés autour de chaque grand noyau de macrophage coloré au DAPI.