Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 5:28 min • July 8th, 2025
Commencez par une culture de cellules endothéliales.
Remplacez le support par un support anaérobie. Incuber dans une chambre anaérobie pour l’équilibrage de la température.
Ajoutez Porphyromonas gingivalis, une bactérie anaérobie pathogène, et incubez brièvement.
Les bactéries possèdent des projections protéiques, appelées fimbriae, qui se lient à des molécules d’adhésion spécifiques sur les cellules endothéliales, facilitant ainsi l’adhésion bactérienne.
Cette liaison déclenche des cascades de signalisation intracellulaire, entraînant un réarrangement du cytosquelette d’actine et une internalisation bactérienne dans les phagosomes.
Après l’incubation, retirer le milieu. Laver avec un tampon anaérobie pour éliminer les bactéries extracellulaires non adhérentes.
Ajoutez un détergent doux pour perméabiliser les membranes des cellules hôtes et induire la lyse cellulaire, libérant les bactéries internalisées et attachées à la surface sans causer de dommages.
Diluez les bactéries contenant du lysat avec un milieu et préparez des dilutions en série.
Placez ces dilutions sur des plaques de gélose au sang. Incuber dans des conditions anaérobies pour permettre à Porphyromonas gingivalis de proliférer et de former des colonies.
Après l’incubation, compter les unités formant colonies (UFC) sur chaque plaque pour quantifier les bactéries attachées à la surface et internalisées, indiquant les interactions bactéries-cellules hôtes.
Pour la culture et l’expérimentation avec Porphyromonas gingivalis, une chambre anaérobie en vinyle est maintenue avec une atmosphère artificielle contenant 80 % d’azote, 10 % d’hydrogène et 10 % de dioxyde de carbone.
Placez 30 plaques de gélose au sang, 500 millilitres de PBS et des millilitres de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, ou milieu VEGF, à l’intérieur de la chambre anaérobie 24 heures à l’avance pour équilibrer les réactifs.
Ensemencez 4 fois 10 à 5 cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, ou HUVEC, par puits dans des plaques à six puits dans un milieu VEGF et laissez-les dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit pour la fixation. Préparez des cultures de Porphyromonas gingivalis en perfusion cerveau-cœur, ou milieu BHI, comme décrit dans le texte d’accompagnement, et laissez les cultures atteindre la phase logarithmique tandis que la densité optique de la culture à 660 nanomètres varie entre 0,5 et 0,7.
Transférez les bactéries dans un tube de 15 millilitres et enroulez un morceau de parafilm autour du capuchon pour éviter l’exposition aérobie. Ensuite, centrifugez les bactéries à 5 000 fois g pendant 10 minutes. À l’intérieur de la chambre anaérobie, lavez les bactéries granulées avec du PBS anaérobie et essorez-les à nouveau à 5 000 fois g pendant 10 minutes. Remettez les bactéries en suspension dans le milieu VEGF.
Pour infecter les HUVECs avec Porphyromonas gingivalis, transférez les plaques à six puits de l’incubateur à la chambre anaérobie. Aspirez le milieu des puits d’essai et lavez-le trois fois avec du PBS anaérobie.
Déterminer le numéro de cellule d’un puits représentatif par un test d’exclusion au bleu de trypan. Ensuite, ajoutez 2 millilitres par puits de milieu anaérobie VEGF et placez les plaques à 37 degrés Celsius dans l’incubateur anaérobie pendant 20 minutes pour équilibrer.
Déterminer la densité optique des bactéries et les remettre en suspension dans un volume adéquat de milieu VEGF pour infecter les cellules à une multiplicité d’infection de 100 pour 1 rapport bactéries/cellules. Ajoutez la suspension bactérienne aux cellules et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius pour l’infection. Pour la lyse cellulaire, à l’intérieur de la chambre anaérobie, préparez une solution de saponine à 1 % en poids par volume dans un milieu BHI et filtrez à travers un filtre de 0,2 micron
.Pour étudier les interactions bactériennes avec les cellules hôtes, retirez la plaque à six puits de l’incubateur et aspirez le milieu infectieux. Laver trois fois avec du PBS anaérobie. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de solution de saponine dans chaque puits et incubez pendant 15 minutes pour permettre la lyse cellulaire.
Ensuite, grattez les cellules du fond du puits et diluez le lysat cellulaire 1 à 1 avec un milieu BHI. Ensuite, faites des dilutions en série en commençant par 1 à 100. Plaque de 200 microlitres d’une dilution appropriée sur plaques de gélose au sang. Enveloppez les plaques avec du parafilm et incubez-les dans un incubateur anaérobie à 37 degrés Celsius pendant sept jours pour permettre la formation de colonies. Ensuite, à l’aide d’une boîte lumineuse, comptez les unités formant des colonies, ou UFC, sur chaque assiette.