Visualisation de bactéries anaérobies internalisées dans les cellules endothéliales de l’hôte

Commencer par une suspension de Porphyromonas gingivalis en croissance active, une bactérie pathogène anaérobie.

Ajoutez BCECF-AM, un colorant non fluorescent et perméable aux cellules.

Les estérases cytoplasmiques actives hydrolysent le colorant sous une forme fluorescente et imperméable aux cellules, colorant les bactéries.

centrifugeuse. Remettre les bactéries en suspension dans un milieu anaérobie.

Ajoutez les bactéries marquées dans des puits de plaques multipuits contenant des lamelles avec des cellules endothéliales humaines collées.

Incuber dans une chambre anaérobie.

Les fimbriae bactériennes se lient aux récepteurs de surface des cellules endothéliales, initiant des cascades de signalisation intracellulaire.

Cela conduit à un réarrangement de l’actine et à l’internalisation bactérienne dans les phagosomes.

Après l’incubation, laver les lamelles avec un tampon pour éliminer les bactéries non internalisées.

Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde pour préserver les structures cellulaires. Perméabiliser les cellules avec un détergent non ionique pour accéder aux cibles intracellulaires.

Ajoutez de la phalloïdine marquée par fluorescence, qui se lie aux filaments d’actine.

Placez la lamelle sur un support de montage contenant du DAPI, qui tache l’ADN.

Observez la fluorescence de Porphyromonas gingivalis dans les cellules endothéliales avec de l’actine fluorescente, confirmant l’internalisation bactérienne.

Pour visualiser les bactéries internalisées, transférez d’abord de manière aseptique des lamelles en verre autoclavé à l’intérieur de chaque puits d’une plaque de 12 puits. Plaquez cinq fois 10 aux quatre HUVECs par puits sur la lamelle de recouvrement et incubez pendant 24 heures. Pour marquer les bactéries, centrifugez les bactéries en phase mi-logarithmique et remettez en suspension la pastille avec du PBS anaérobie. Centrifugez à nouveau et répétez l’étape de lavage.

Ajoutez 20 microlitres de BCECF-AM de 0,2 millimolaire à deux millilitres de PBS anaérobie contenant cinq à sept fois 10 à huit bactéries par millilitre. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans l’obscurité.

Le colorant fluorescent que nous utilisons peut tacher la plupart des bactéries anaérobies. Ainsi, aucun autre réactif, tel qu’un anticorps spécifique, n’est nécessaire.

Centrifugez la suspension bactérienne à 5 000 fois g pendant 10 minutes pour éliminer le réactif d’étiquetage non lié, puis remettez les bactéries en suspension dans le milieu VEGF. Ensuite, infectez les cellules HUVEC dans un rapport de 100 à 1, bactéries par cellules, et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez le milieu d’infection et lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez 4 % de paraformaldéhyde et incubez à température ambiante pendant 10 minutes pour fixer les cellules dans la chambre anaérobie.

Retirez les cellules fixes de la chambre, puis lavez les lamelles avec du PBS trois fois. Incuber les lamelles dans un millilitre de Triton X-100 à 0,2 % pendant 10 minutes pour perméabiliser les cellules. Ensuite, lavez les lamelles avec du PBS trois fois. Maintenant, ajoutez 50 microlitres de 50 microgrammes par millilitre de phalloïdine TRITC à chaque lamelle et incubez pendant 45 minutes à température ambiante pour colorer l’actine oligomère cellulaire.

Après l’incubation, lavez trois fois la lamelle avec du PBS. Inversez la lamelle sur une lame de verre avec un support de montage à prise souple contenant un microgramme par millilitre de DAPI pour la coloration nucléaire. Ensuite, scellez la périphérie de la lamelle avec du vernis à ongles et observez sous microscopie confocale.