Évaluation de l’activité de destruction des opsonophagocytes contre les agents pathogènes bactériens

Commencez avec une plaque multi-puits contenant une suspension de Streptococcus pneumoniae.

Introduire des anticorps ciblant les antigènes de surface bactériens, qui interagissent avec les antigènes de surface bactériens. Cela enrobe les bactéries d’anticorps, formant des bactéries opsonisées pour la reconnaissance immunitaire.

Ensemencez les puits avec des neutrophiles dérivés de lymphocytes du sang périphérique humain complétés par du sérum de lapin contenant des protéines du complément.

Au cours de l’incubation, les protéines du complément telles que C3b se déposent à la surface de la bactérie, ce qui entraîne un revêtement supplémentaire d’opsonine sur les bactéries opsonisées par les anticorps, améliorant ainsi la reconnaissance bactérienne par les neutrophiles.

Les récepteurs de surface spécifiques sur les neutrophiles interagissent avec les opsonines sur les bactéries, facilitant l’engloutissement bactérien par phagocytose.

À l’intérieur du phagosome, les neutrophiles dégradent les bactéries englouties, réduisant ainsi le nombre de bactéries dans le tampon.

Après l’incubation, placez la solution de co-culture diluée sur une plaque de gélose au sang pour permettre aux bactéries individuelles de former des colonies.

Comparez le nombre de colonies dans les bactéries traitées à l’opsonine à celui des bactéries non traitées.

Moins de colonies traitées à l’opsonine indiquent une destruction bactérienne plus élevée, ce qui suggère une destruction opsonophagocytaire réussie.

Décongeler un tube de bouillon bactérien. Appliquez les bactéries du granulé à 6 000 fois g pendant deux minutes, et remettez en suspension le granule cellulaire dans l’OBB à la dilution optimale obtenue à l’étape précédente. Pipette de 10 microlitres de dilution bactérienne remise en suspension par puits dans une plaque de culture cellulaire à fond rond de 96 puits. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’un anticorps approprié ou d’un traitement médicamenteux à chaque puits expérimental en double.

Pour les puits de contrôle, utilisez 1X PBS ou OBB, selon le tampon utilisé pour les puits de traitement. Agitez la plaque d’échantillonnage à environ 90 tr/min à température ambiante pendant une heure.

Pour récolter les cellules différenciées par HL60 qui sont traitées avec du DMF trois jours auparavant, granulez les cellules à 500 fois g pendant trois minutes. Jetez le surnageant et lavez la pastille avec au moins 10 millilitres de 1XPBS. Granulez les cellules lavées à 500 fois g pendant trois minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans OBB.

Ajouter du sérum stérile non dilué pour bébé lapin à raison d’un à cinq volumes finaux. Après une culture bactérienne d’une heure, divisez chaque échantillon en deux groupes. Ensuite, ajoutez 50 microlitres du mélange de complément HL60 à chaque ensemble expérimental de puits et 50 microlitres d’OBB aux puits de bactéries uniquement. Agitez la plaque à 96 puits à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Pour plaquer les échantillons, diluez chaque puits avec de l’OBB à un à cinq volumes finaux afin que chaque échantillon ait un volume d’au moins 50 microlitres. Ensuite, pipetez 50 microlitres de chaque échantillon directement sur une zone désignée d’une plaque de culture bactérienne, en veillant à ce que l’espacement soit adéquat entre les échantillons. Couvrir et laisser sécher les échantillons pendant environ 15 minutes à température ambiante.

Renversez les assiettes et cultivez toute la nuit à 30 degrés Celsius. Alternativement, des plaques de culture dans des bocaux anaérobies, pour tester si les conditions anoxiques affectent la croissance bactérienne ou pour contrôler la morphologie. Après la culture pendant la nuit, comptez les colonies dans chaque zone d’échantillonnage désignée et procédez à l’analyse des données en comparant le nombre de cellules vivantes dans chaque ensemble aux témoins correspondants.

Les aspects les plus difficiles de la mise en place de cette technique pour la première fois seront probablement d’optimiser les UFC de départ du stock bactérien, ainsi que de s’assurer que les cellules HL60 sont efficacement différenciées.