Évaluation de Porphyromonas gingivalis internalisée dans les cellules endothéliales de l’hôte

Lors de l’infection à Porphyromonas gingivalis, les fimbriae des bactéries anaérobies se lient à des récepteurs spécifiques sur les cellules hôtes.

Cette liaison initie des cascades de signalisation intracellulaire, entraînant un réarrangement de l’actine et une internalisation bactérienne au sein des phagosomes.

Pour évaluer la survie de Porphyromonas gingivalis internalisée dans les cellules endothéliales in vitro, prenez une plaque multipuits contenant des cellules endothéliales adhérées à des lamelles.

Ajouter la suspension de Porphyromonas gingivalis. Incuber pour faciliter l’internalisation bactérienne.

Retirez le support et lavez-le à l’aide d’un tampon anaérobie pour éliminer les bactéries non internalisées.

Ajouter un milieu contenant des antibiotiques, imperméables aux cellules endothéliales, pour éliminer les bactéries attachées à la surface.

Incuber avec un tensioactif doux pour lyser les cellules endothéliales, libérant les bactéries sans provoquer leur lyse.

Diluez le lysat collecté avec un milieu. Préparez des dilutions en série du lysat.

Déposer les dilutions sur des plaques de gélose au sang. Incuber dans des conditions anaérobies pour permettre à Porphyromonas gingivalis de se développer et de former des colonies visibles.

Comptez les colonies pour évaluer la capacité de Porphyromonas gingivalis à envahir et à survivre dans les cellules endothéliales.

Après l’infection des cellules HUVEC, laver les cellules trois fois avec du PBS anaérobie. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de milieu VEGF complété par des concentrations pré-optimisées d’antibiotiques aux cellules HUVEC. Incuber les cellules pendant une heure. Aspirez le milieu et ajoutez 2 millilitres de solution de saponine à 1 % dans du BHI dans chaque puits. Incuber pendant 15 minutes.

Ensuite, grattez les cellules lysées et collectez le lysat dans un tube à centrifuger. Diluez le lysat 1 à 1 avec un milieu BHI, puis préparez des dilutions en série commençant à 1 à 100. Plaque de 200 microlitres des concentrations appropriées sur des plaques de gélose au sang. Laissez la bactérie se développer pendant sept jours dans une chambre anaérobie, puis comptez les colonies.