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Immunologie
0 vues • 3:18 min • July 8th, 2025
Commençons par les sous-populations de macrophages adhérents M1 et M2, qui se distinguent par leurs marqueurs de surface spécifiques. Ces cellules sont infectées par Mycobacterium tuberculosis, marqué par fluorescence.
Ajouter un tampon FACS aux puits de culture.
L’EDTA dans le tampon permet de détacher les cellules des puits de culture.
Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation.
Centrifugez les tubes. Jetez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans un cocktail d’anticorps anti-macrophages conjugué au fluorochrome et un colorant de viabilité, Zombie-UV.
Le colorant de fluorescence Zombie-UV pénètre dans les cellules mortes à travers les membranes endommagées et se lie aux protéines cytoplasmiques, permettant une différenciation claire des cellules viables non colorées.
De plus, les anticorps anti-macrophages conjugués par fluorescence se lient aux antigènes cibles sur les macrophages, ce qui permet une détection différentielle des sous-populations.
Lavez les cellules pour éliminer les anticorps non liés. Centrifugeuse. Retirez le surnageant.
Remettre les cellules en suspension dans un tampon fixateur pour réticuler les protéines, préserver la morphologie cellulaire et inactiver les mycobactéries pour une manipulation sûre pendant l’analyse.
Enfin, centrifugez et traitez les échantillons pour la cytométrie en flux.
Utiliser une stratégie de contrôle appropriée pour déterminer le pourcentage de sous-populations infectées par Mycobacterium.
Pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux, incubez les cellules infectées avec 1 millilitre de tampon FACS complété par 0,5 millimolaire d’EDTA par puits pendant au moins 30 minutes. À la fin de l’incubation, collectez les cellules détachées à l’aide d’un pipetage doux, puis transférez-les dans des tubes de microcentrifugation individuels à bouchon vissé pour la centrifugation.
Remettez les cellules en suspension dans environ 50 microlitres de cocktail d’anticorps anti-humains conjugués au fluorochrome et de colorant de viabilité d’intérêt, et incubez les cellules pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius à l’abri de la lumière.
Après le lavage, fixez les cellules avec 200 microlitres de tampon de fixation fraîchement préparé pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Après la fixation et le lavage, mettez les cellules en suspension dans 400 microlitres de tampon FACS et transférez les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1 millilitre.
Pour analyser les cellules, utilisez des billes de compensation pour compenser le signal fluorescent pour chaque anticorps conjugué au fluorochrome dans le cocktail, et utilisez des cellules non colorées pour définir la porte pour la population cellulaire négative. Ensuite, acquérez un minimum de 50 000 cellules par échantillon.