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Immunologie
0 vues • 5:27 min • July 8th, 2025
Prenez une culture de cellules cancéreuses avec des protéines cytoplasmiques marquées par fluorescence.
Ajoutez des cellules tueuses induites par des cytokines ou CIK - des cellules T effectrices avec des caractéristiques naturelles de type cellule tueuse - possédant une activité antitumorale.
Les récepteurs tueurs naturels du groupe 2 membre D ou NKG2D sur les cellules CIK se lient aux protéines induites par le stress sur les cellules cancéreuses.
La liaison induit les cellules CIK à libérer des toxines granulaires cytoplasmiques - perforines et granzymes.
Les perforines forment des pores dans la membrane cellulaire cancéreuse, permettant l’entrée des granzymes, qui activent les caspases, induisant l’apoptose.
Après l’incubation, récoltez les cellules. Ajoutez un colorant fluorescent de viabilité cellulaire de liaison aux acides nucléiques.
Le colorant pénètre à travers la membrane cellulaire endommagée et se lie à l’ADN, ce qui entraîne des cellules mortes à double coloration.
Avec une membrane cellulaire intacte, les cellules vivantes sont imperméables au colorant.
Faites passer les cellules dans un cytomètre en flux pour détecter les cellules vivantes présentant une fluorescence simple et les cellules mortes à double fluorescence.
Créez un nuage de points pour mesurer le pourcentage de cellules cancéreuses mortes, en quantifiant l’effet cytotoxique des cellules CIK.
Pour effectuer le test cytotoxique, co-cultivez CIK et des cellules de leucémie myéloïde chronique humaine K562, en ajoutant 1 millilitre de cellules K562 dans chaque puits dans une plaque à 6 puits à une densité de 0,5 million de cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de milieu basal avec ou sans cellules CIK dans la plaque à 6 puits, comme indiqué dans le protocole de texte. Mélangez les suspensions cellulaires en pipetant doucement de haut en bas au moins trois fois.
Placez la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures. Maintenant, co-cultivez des cellules CIK et OC-3 ovariennes en ajoutant 1 millilitre de milieu basal avec ou sans cellules CIK à la plaque à 6 puits, comme indiqué dans le protocole de texte. Mélangez les suspensions cellulaires en pipetant doucement de haut en bas au moins trois fois avec la lame dans l’incubateur pendant 24 heures. Après l’incubation, récoltez la suspension cellulaire CIK-K562 directement dans un tube stérile de 15 millilitres.
Pour récolter à la fois la suspension et les cellules adhérentes des groupes CIK-OC-3, transférez d’abord la suspension cellulaire dans un tube stérile de 15 millilitres. Lavez le puits avec 1 millilitre de PBS stérile. Récupérez le PBS et ajoutez-le dans le tube. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de solution d’enzyme de dissociation cellulaire et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.
Ajoutez 1 millilitre de la solution du même tube dans le puits correspondant et mélangez doucement les cellules en pipetant de haut en bas au moins trois fois avec une pipette stérile de 1 millilitre. Rassemblez toutes les cellules dans le même tube. Centrifuger à 300 x g pendant 10 minutes. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 millilitre de PBS stérile. Granulez les cellules à 300 x g pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBS stérile.
Ajoutez 5 microlitres de colorant 7-AAD à la suspension cellulaire. Mélangez doucement les cellules en pipetant de haut en bas au moins trois fois avec une pipette stérile de 1 millilitre. Incuber pendant 10 minutes et laisser dans l’obscurité avant l’analyse.
Pour effectuer le test de capacité cytolytique, mélangez la suspension cellulaire et répétez la préparation pour la cytométrie en flux. Cliquez sur le bouton New Specimen (Nouvel échantillon) pour ajouter un échantillon et un tube à l’expérience. Nommez les tubes comme indiqué dans le protocole texte.
Pour créer un système de scatter gating pour le test cytolytique, sélectionnez d’abord le tube 1 et cliquez sur le bouton Dot Plot. Pour créer un tracé FSC-A/SSC-A, tracez une porte rectangulaire sur tous les événements avec un seuil FSC-A supérieur à 50 000 afin d’exclure les débris de cellule. Sélectionnez le paramètre SSC-A/CFSE pour le nouveau diagramme à points. Ensuite, sélectionnez le paramètre 7-AAD/CFSE pour le nouveau graphique à points et dessinez une porte à quatre quadrants pour définir les quatre sous-populations.
Cliquez sur le bouton Charger l’échantillon pour analyser d’abord l’échantillon de contrôle vierge. Ajustez la tension du SSC-A et du FSC-A. Identifiez la population de cellules mortes à l’aide des paramètres CFSE et 7-AAD. Enregistrez les données de plus de 20 000 cellules positives au CFSE dans chaque échantillon. Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques de chaque échantillon individuel pour analyser les populations de cellules non viables, et exportez les données dans des fichiers d’analyse.