Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:40 min • July 8th, 2025
Prenez des cellules leucémiques dans des milieux de croissance sans facteurs stimulants tels que les cytokines et incuberez-les.
L’absence de facteurs stimulants permet aux protéines phosphorylées intracellulaires de subir une déphosphorylation et de revenir à leur état natif.
Centrifugez et retirez le média. Remettre en suspension les cellules dans le stroma-surnageant contenant la cytokine, la lymphopoïétine stromale thymique, ou TSLP.
TSLP se lie à son récepteur sur la cellule leucémique, déclenchant la dimérisation du récepteur.
Cela rapproche les deux kinases associées à Janus, ou JAK, facilitant la transphosphorylation mutuelle.
Les JAK activés phosphorylent les queues cytoplasmiques du récepteur, créant des sites d’amarrage pour le transducteur de signal et l’activateur de la transcription, les monomères STAT.
Une fois phosphorylés, les STAT se dimérisent et se détachent du récepteur pour réguler les processus cellulaires en aval.
Fixer les cellules pour maintenir les états de phosphorylation des protéines intracellulaires.
Traitez les cellules avec une solution de perméabilisation pour augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire.
Ajoutez des anticorps marqués par fluorescence pour marquer les protéines phosphorylées.
La mesure cytométrique en flux du signal de fluorescence est en corrélation avec la phosphorylation STAT induite par TSLP.
Pour valider le surnageant produit à partir d’un stroma modifié, décongelez les échantillons de surnageant récoltés à partir du contrôle dans un stroma exprimant des cytokines, et mettez en plaque 3 puits de lignées cellulaires de leucémie par condition dans un milieu R20 à une concentration de 2 fois 10 à la cinquième cellule par puits dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits. Incuber les cellules pendant deux heures à 37 degrés Celsius pour permettre la perte de phosphorylation de leur culture précédente.
Ensuite, transférez les cellules de chaque puits dans des tubes individuels de 4 millilitres et collectez les cellules par centrifugation. Remettre les pastilles en suspension dans 600 microlitres par condition expérimentale, et plaquer 200 microlitres de cellules par puits pour chaque condition en trois exemplaires. Incuber les cellules pendant la période appropriée en fonction du dosage phosphologique commercial spécifique.
À la fin de l’incubation, granulez les cellules par centrifugation, et marquez les cellules par coloration par cytométrie phospho-flux selon le protocole du fabricant. Ensuite, analysez les cellules par cytométrie en flux à l’aide de protocoles d’analyse cytométriques en flux standard pour vérifier que les cytokines du surnageant du stroma phosphorylent les cellules leucémiques.