Visualisation de bactéries dans des coupes de biopsie de la vessie par hybridation in situ par fluorescence

Commencez par une lame de verre portant une section de tissu de biopsie de la vessie urinaire infectée déparaffinisée et réhydratée contenant des bactéries uropathogènes.

Introduire des sondes universelles marquées par fluorescence - un oligonucléotide simple brin complémentaire spécifique à la région conservée de l’ARN ribosomique 16s bactérien, ou ARNr 16s.

Incuber la lame dans l’obscurité à une température élevée pour une hybridation optimale.

Pendant l’incubation, les sondes s’hybrident exclusivement dans la région conservée sur l’ARNr bactérien 16s, conférant une fluorescence verte aux bactéries.

Après l’hybridation, laver avec un tampon préchauffé pour retirer les sondes non liées.

Teindre la coupe de tissu avec un colorant Hoechst et des marqueurs de protéines cellulaires marqués au fluorophore.

Les molécules de Hoechst se lient à l’ADN, colorant les noyaux en bleu, tandis que les marqueurs marqués au fluorophore interagissent avec des composants cellulaires spécifiques tels que les filaments de mucine et d’actine, conférant une fluorescence rouge dans la section de biopsie.

Lavez la lame et ajoutez du support de montage à la section du mouchoir.

Au microscope confocal, la fluorescence verte dans la section de biopsie de la vessie porteuse de fluorescence rouge confirme la présence de bactéries associées aux tissus.

Préparez une chambre d’humidification pour chaque sonde en ajoutant une lingette trempée, froissée et délicate et de l’eau stérile dans le réservoir d’une boîte d’embouts P1000. Placez la cartouche porte-embout sur le dessus, car c’est là que les diapositives reposeront. Une fois le lavage final terminé, retirez les diapositives du support à glissières et placez-les sur une serviette en papier fraîche, côté mouchoir vers le haut. Utilisez une lingette délicate pour sécher la lame, en prenant soin de ne tamponner doucement que près de la section de biopsie, mais pas sur celle-ci, pour évacuer l’eau. À l’aide d’un stylo hydrophobe, tracez une bordure autour de la section de biopsie et placez la lame, côté tissu vers le haut, dans la chambre d’humidification.

Ensuite, placez la chambre d’humidification dans un incubateur réglé à 50 degrés Celsius. Pipetez entre 50 et 150 microlitres de la solution de coloration directement sur le tissu de sorte que le rectangle formé par la bordure hydrophobe autour du tissu soit rempli, et fermez doucement la boîte. Incuber toute la nuit à 50 degrés Celsius dans l’obscurité. Si l’incubateur a une fenêtre, couvrez-la de papier d’aluminium pour créer un environnement sombre.

Le lendemain matin, retirez les lames des chambres d’humidification et évacuez rapidement toute solution d’hybridation restante avec une lingette délicate. Ensuite, placez les lames dans un support de coloration vertical. Placez la grille de coloration dans un pot coplin enveloppé de papier d’aluminium contenant 100 ml de tampon de lavage préchauffé pendant 10 minutes. Répétez cette étape de lavage deux fois de plus avec un tampon de lavage frais dans de nouveaux pots coplin.

Au cours de ces étapes de lavage, préparez la contre-teinture en diluant une solution mère de Hoechst 33342 dans un tampon de lavage dans un rapport de 1 à 1 000. Dans le même tube, ajoutez l’agglutinine de germe de blé Alexa-555 à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre et la phalloïdine Alexa-555 à une concentration finale de 33 nanomolaires. Conserver dans l’obscurité jusqu’au moment de l’utiliser.

Une fois le lavage final terminé, retirez les lames du pot coplin et évacuez doucement tout excès de tampon de lavage avec une lingette délicate. Placez les lames côté tissu vers le haut sur une serviette en papier et ajoutez entre 50 et 150 microlitres de contre-coloration directement sur le tissu afin que la bordure hydrophobe soit remplie mais ne déborde pas. Couvrez jusqu’à quatre lames avec un couvercle de cryoboîte et incubez à température ambiante pendant 10 minutes.

Après cela, remettez les lames dans le support de coloration et lavez-les deux fois de plus dans des bocaux coplin contenant un tampon de lavage frais, chaque lavage durant 10 minutes. Ensuite, séchez soigneusement les lames et placez-les côté tissu vers le haut sur une serviette en papier sous le dessus d’une cryoboîte. Pressez une goutte de support de montage directement sur le mouchoir et placez délicatement une lamelle de taille appropriée sur le dessus. Doucement, pressez les bulles et laissez les lames glissées durcir toute la nuit dans l’obscurité. Le lendemain, scellez les bords des lamelles sur la lame avec une légère couche de vernis à ongles transparent et laissez sécher dans l’obscurité pendant 10 minutes, avant de les stocker dans l’obscurité à 4 degrés Celsius.

Lorsque vous êtes prêt à imager les biopsies colorées, allumez le microscope confocal et le logiciel associé au microscope. Commencez par une diapositive positive à FISH et passez en mode de visualisation par ordinateur. Sélectionnez les canaux pour 405, 488 et 555. Réglez le sténopé à l’aide du canal de longueur d’onde le plus long, qui dans ce cas est de 555. Ensuite, trouvez le plan focal actuel pour la visualisation des bactéries marquées dans le canal 488. Sans modifier le plan focal, réglez le gain, la puissance laser et le décalage pour chaque canal, de sorte que le signal ne soit pas saturé et que l’arrière-plan ne soit pas surcorrigé. Acquérez l’image dans les trois canaux.