Une technique in vitro pour la génération de lymphocytes T apoptotiques par irradiation UV

Prenez une suspension de cellules de Jurkat – cellules de leucémie des lymphocytes T.

Mélangez une aliquote avec un colorant de viabilité cellulaire et assurez-vous d’un nombre adéquat de cellules vivantes.

Placez les cellules dans une boîte de culture et appliquez un rayonnement ultraviolet C ou UVC pendant la durée requise.

Les UVC pénètrent dans les cellules et sont absorbés par l’ADN, formant des photoproduits de pyrimidine.

Après l’irradiation, incuber les cellules. Des dommages étendus à l’ADN médiés par les UVC initient la voie intrinsèque de l’apoptose, activant les protéines pro-apoptotiques sur la membrane mitochondriale externe.

Les protéines activées s’oligomérisent, formant des pores membranaires et libérant le cytochrome C de l’espace intermembranaire dans le cytoplasme.

Complexes du cytochrome C avec le facteur d’activation de la protéase apoptotique-1, formant un complexe apoptosome. L’apoptosome active les caspases, provoquant l’apoptose.

Introduisez de l’annexine V marquée au fluorophore pour marquer la phosphatidylsérine sur la membrane, un marqueur cellulaire apoptotique, et ajoutez de l’iodure de propidium qui pénètre à travers la membrane endommagée pour marquer l’ADN.

À l’aide de la cytométrie en flux, déterminez les cellules apoptotiques précoces marquées en V à l’annexine et les cellules apoptotiques tardives à double coloration.

Commencez par cultiver des cellules T Jurkat dans un milieu de culture basocellulaire, complété selon les instructions du manuscrit, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Les lymphocytes T Jurkat sont une lignée cellulaire en suspension qui peut être maintenue par passage dans un milieu de culture préchauffé tous les trois jours.

Préparez les cellules apoptotiques en les faisant croître jusqu’à 90 % de confluence, ce qui prend trois à quatre jours après le passage. Cultivez des cellules dans cinq flacons T75, afin d’obtenir un nombre suffisant de cellules pour ce protocole. Une fois que les cellules sont prêtes, aspirez le contenu du ballon d’environ 24 millilitres et transférez-le dans un tube conique de 50 millilitres. Comptez les cellules à l’aide d’une coloration au bleu de trypan et d’un hémocytomètre.

Granulez les cellules par centrifugation à 271 fois g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans le milieu pour obtenir trois millions de cellules par millilitre. Aliquote les cellules dans des boîtes de culture tissulaire de 100 x 20 millimètres en transférant cinq millilitres de cellules par boîte.

Préparez environ neuf plats de culture. Mettez une parabole de côté comme commande non exposée et exposez les autres paraboles aux UV. Réglez l’agent de réticulation UV sur le bon niveau d’énergie en appuyant sur le bouton d’énergie et en entrant « 600 » avec le pavé numérique. Irradiez toutes les boîtes avec les cellules à l’exception du contrôle, en veillant à retirer le couvercle supérieur de la boîte de culture tissulaire lors de l’exposition aux UV.

Ensuite, incubez toutes les paraboles dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures. Après l’incubation, combinez toutes les cellules irradiées dans un tube conique de 50 millilitres et granulez-les par centrifugation à 271 fois g pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 24 millilitres de PBS stérile. Centrifugez à nouveau le tube et retirez le surnageant.