Analyse de l’activation des basophiles en présence d’un allergène de test à l’aide de la cytométrie en flux

Prenez des tubes cytométriques contenant un mélange de coloration composé d’anticorps monoclonaux marqués par fluorescence en suspension dans un tampon de stimulation.

Ajoutez des concentrations décroissantes de l’allergène d’essai dans plusieurs tubes. Ajoutez des anticorps anti-IgE dans un tube pour servir de contrôle positif médié par les IgE, et ajoutez un tampon dans un autre tube pour le contrôle négatif.

Pipeter le sang périphérique humain dans les tubes. Couver.

Si la personne est sensibilisée à l’allergène d’essai, cette exposition fait en sorte que l’allergène se lie aux anticorps IgE spécifiques de l’allergène liés aux récepteurs Fc à la surface du basophile.

Les allergènes réticulent les récepteurs Fc liés aux IgE, provoquant l’activation des basophiles.

Les basophiles subissent une dégranulation, libérant des granules intracellulaires contenant des médiateurs inflammatoires, avec la régulation positive des molécules CD63 et CD203c.

Les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence se lient à CD63, CD203c et CCR3 chez les basophiles, respectivement.

Baissez la température pour arrêter la dégranulation des basophiles.

Ajouter un tampon pour lyser les érythrocytes et fixer les cellules.

À l’aide d’un cytomètre en flux, identifiez les basophiles de la population lymphocytaire.

En utilisant CD63 comme marqueur d’activation, analysez l’activation des basophiles à des concentrations décroissantes d’allergènes.

Commencez par prélever du sang périphérique dans des tubes héparinés de 9 millilitres et placez les échantillons dans un rotor pour les maintenir à température ambiante jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires au protocole expérimental.

Étiquetez deux tubes cytométriques de 5 millilitres chacun pour le contrôle négatif et le contrôle positif. De plus, étiquetez un tube pour les différentes concentrations d’allergènes ou de médicaments testés. Ensuite, placez les tubes dans un rack afin qu’ils s’emboîtent parfaitement sans glisser.

Pour le premier contrôle positif, préparez une solution de 4 micromolaires de N-Formylméthionyl-leucyl-phénylalanine, ou fMLP, dans du PBST à 0,05 % pour confirmer la qualité des basophiles. Pour le deuxième témoin positif, préparer une solution anti-IgE de 0,05 milligramme par millilitre à l’aide de PBST. Préparez le mélange de coloration en ajoutant 1 microlitre d’anticorps CCR3-APC, CD203c-PE et CD63-FITC pour 20 microlitres de tampon de stimulation. Ensuite, ajoutez 23 microlitres de ce mélange de coloration dans chaque tube.

Ajoutez 100 microlitres de PBST dans les tubes de contrôle négatif, ajoutez 100 microlitres de fMLP dans l’un des tubes de contrôle positif et ajoutez 100 microlitres d’anti-IgE dans l’autre. Au reste des tubes, ajoutez 100 microlitres des différentes concentrations d’allergènes ou de médicaments, et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, ajoutez doucement 100 microlitres de sang dans chaque tube pour éviter l’hémolyse. Ensuite, faites tourbillonner doucement les tubes et incubez-les pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius dans le bain thermostatique avec une agitation moyenne.

Maintenez les tubes à 4 degrés Celsius pendant au moins cinq minutes pour arrêter la dégranulation. Dans chaque tube, ajoutez 2 millilitres de tampon de lyse pour lyser les érythrocytes. Vortex chaque tube, puis incubez les tubes pendant 5 minutes à température ambiante. Centrifugez les tubes à 300 x g à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Ensuite, renversez le support dans l’évier pour décanter le surnageant pendant que les cellules restent au fond des tubes. Ajoutez 3 millilitres de PBST dans chaque tube pour laver les cellules et vortex les tubes. Effectuez un deuxième cycle de centrifugation en utilisant le même ensemble de paramètres et décantez le surnageant en renversant le support dans l’évier. Ensuite, conservez les échantillons à 4 degrés Celsius, à l’abri de la lumière jusqu’à la cytométrie en flux.

Connectez le cytomètre en flux au logiciel de l’ordinateur et attendez que le cytomètre soit prêt. Chargez les paramètres du modèle et de l’instrument comme décrit dans le manuscrit de texte. Lancez le processus d’acquisition de l’échantillon.

Pour sélectionner des basophiles activés, récupérez d’abord les lymphocytes à partir du graphique de dispersion latérale - Nuage de points avant. Ensuite, récupérez les basophiles de la population lymphocytaire sous forme de cellules CD203c positives CCR3-positives, et acquérez au moins 500 basophiles par tube. Réglez le seuil CD63 négatif à environ 2,5 % à l’aide des tubes de contrôle négatifs et analysez les échantillons.