Suivi des leucocytes basé sur la photoconversion chez le poisson-zèbre transgénique infecté par des bactéries

Commencez par une boîte contenant des larves de poisson-zèbre transgéniques, anesthésiées et incorporées dans de l’agarose exprimant la protéine fluorescente photoconvertible dans leurs leucocytes - cellules immunitaires phagocytaires.

La vésicule otique gauche, pré-injectée avec des bactéries marquées d’un colorant fluorescent rouge, est positionnée à plat contre le fond de la boîte.

À l’intérieur de la vésicule otique, des bactéries pré-injectées provoquent une infection locale, déclenchant la migration des cellules immunitaires et la libération de chimiokines, provoquant une infiltration de leucocytes dans la vésicule otique.

Au microscope à fluorescence, observez le recrutement initial des leucocytes verts et la phagocytose des bactéries rouges par les leucocytes au site de l’infection.

Illuminez la vésicule otique avec une longueur d’onde de 405 nanomètres, transformant de manière irréversible la protéine fluorescente photoconvertible du vert au rouge et conférant une fluorescence rouge aux leucocytes, ce qui permet une visualisation distincte et un suivi précis.

Maintenant, examinez les larves à deux longueurs d’onde différentes à différentes profondeurs, ce qui permet de visualiser les leucocytes de fluorescence rouges photoconvertis et verts restants.

leucocytes rouges photoconvertis se dispersent à partir des vésicules otiques et se dispersent dans tout le corps, facilitant le suivi des leucocytes basé sur la photoconversion.

Après avoir préparé l’agarose avec de la tricaïne selon le protocole textuel sur la platine du stéréomicroscope, utilisez une pipette de transfert pour placer quatre à cinq larves anesthésiées dans un plat à fond de verre. Retirez la solution de tricaïne et d’agarose du bain-marie à 55 degrés Celsius et laissez-la refroidir à température ambiante pendant 1 à 2 minutes.

Pendant ce temps, retirez autant de liquide que possible des larves anesthésiées. Ensuite, versez l’agarose refroidie dans le plat jusqu’à ce qu’environ la moitié de la surface soit couverte. Ensuite, faites tourner le plat pour étaler l’agarose. Ramassez les larves qui ont flotté sur les côtés du plat et pipetez-les au centre. Ensuite, sous le stéréomicroscope, utilisez une longue pointe de pipette pour positionner doucement les larves comme vous le souhaitez.

Pour imager la vésicule otique, positionnez les larves de manière à ce que la vésicule otique droite soit tournée vers le haut et que la vésicule otique gauche soit à plat contre le fond de la boîte. Laissez refroidir l’agarose pendant environ 10 minutes avant de déplacer le plat. Ensuite, pipetez doucement un peu de tricaïne et de solution E3 sur la couche d’agarose pour la garder humide.

Pour visualiser les échantillons, utilisez un balayage z-stack avec des lasers de 488 nanomètres et 543 nanomètres. Utilisez le balayage linéaire continu pour ajuster la puissance du laser et le gain du détecteur. Vérifiez qu’il n’y a pas de fluorescence rouge photoconvertie accidentellement. Dans la fenêtre « Contrôle d’acquisition d’image », sous « Réglage du stimulus », sélectionnez l’outil « Utiliser le scanner » et choisissez « Principal ». Sélectionnez le laser de 405 nanomètres et réglez-le sur 70 % de puissance. Ensuite, à l’aide de l’option cercle, définissez la région d’intérêt dans la vésicule otique.

Sous le « Réglage de démarrage du stimulus », sélectionnez « Activation en série » avec une pré-activation de 1 image et un temps d’activation de 60 000 millisecondes. Dans la fenêtre « Réglage de l’acquisition », sous l’en-tête « Balayage temporel », choisissez deux intervalles de minutes, chacun pour la conversion pré photo et un pour la conversion post-photo. Démarrez la série time-lapse pour lancer la photoconversion de la région d’intérêt définie. Enfin, scannez l’échantillon à l’aide d’une pile z et des lasers de 488 et 543 nanomètres pour visualiser la fluorescence rouge photoconvertie ainsi que toute fluorescence verte restante.