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Immunologie
0 vues • 3:43 min • July 8th, 2025
Prenez un tube contenant du sang humain fraîchement prélevé et ajoutez-y un tampon de lyse.
Le détergent contenu dans le tampon perméabilise la membrane cellulaire, lyse les cellules et libère des acides nucléiques intracellulaires, ou NA, et des nucléases.
Les agents chaotropiques présents dans le tampon dénaturent les nucléases, empêchant la dégradation de l’NA.
Ajoutez des particules de verre magnétique ou MGP (particules magnétiques recouvertes de silice) et mélangez soigneusement.
Le faible pH du tampon protone la silice, ce qui donne une charge positive à la surface des MGP.
Les NA chargés négativement se lient électrostatiquement à la surface chargée, formant un complexe NA-MGP.
Sous un champ magnétique, les complexes NA-MGP s’accumulent sur le côté du tube.
Jetez le surnageant contenant des débris cellulaires et des protéines.
Effectuez plusieurs étapes de lavage en remettant en suspension les complexes NA-MGP dans un tampon de lavage, en appliquant un champ magnétique pour collecter les complexes et en éliminant le surnageant avec les contaminants restants.
Remettre en suspension les complexes dans un tampon d’élution. Le pH élevé perturbe l’interaction NA-MGP, libérant les NA. Les AN élués sont prêts pour les analyses en aval.
Pour purifier les acides nucléiques du sang collecté, mélangez à nouveau le contenu du tube en retournant le tube à vide à la main 5 à 10 fois. Versez l’aliquote préparée de MGP directement dans le tube de prélèvement sanguin, puis placez un nouveau couvercle d’un tube de prélèvement sanguin inutilisé sur le tube contenant l’échantillon. Placez un doigt sur le couvercle pour vous assurer que le tube est bien fermé et mélangez le contenu du tube en le retournant 5 à 10 fois.
Placez le tube dans le support magnétique et gardez un doigt sur le couvercle pour vous assurer que le tube est bien fermé. Ensuite, retournez plusieurs fois le support magnétique avec le tube pour disperser les MGP avant qu’ils ne s’accumulent sur le côté du tube avec l’aimant. Retirez le couvercle du tube et jetez le contenu du tube dans un tube de collecte de 50 millilitres à l’aide d’une pipette jetable.
Versez l’aliquote préparée de WB1 directement dans le tube de prélèvement sanguin et fermez le couvercle du tube. Mélangez le contenu à la main 5 à 10 fois. Ensuite, récupérez les billes sur le côté du tube à l’aide de l’aimant et retirez le liquide comme précédemment. Remettre les billes en suspension dans l’aliquote préparée de WB2. Ensuite, jetez la solution et répétez la procédure avec l’aliquote préparée de WB3.
Enfin, retirez le tube du support magnétique et versez l’aliquote préparée d’EB directement dans le tube de prélèvement sanguin. Placez le couvercle sur le tube et remettez les MGP en suspension en tapotant 5 à 10 fois avec un doigt. Enfin, à l’aide d’une pipette jetable de 1,5 millilitre, transférez une gouttelette des MGP en suspension dans le mélange réactionnel d’amplification des acides nucléiques en aval.