Mesure de l’exocytose des mastocytes via la libération de la protéine fluorescente rouge monomère du neuropeptide Y
Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:14 min • July 8th, 2025
Prenez des mastocytes transfectés exprimant NPY-mRFP, une protéine de fusion contenant du neuropeptide Y et de la protéine fluorescente rouge monomère, dans leurs granules sécrétoires cytoplasmiques.
Retirez le support. Pipeter un tampon contenant du calcium avec un réactif d’activation, un ionophore de calcium, et incuber.
Ces ionophores induisent un afflux de calcium, augmentant la concentration intracellulaire de calcium et mobilisant les granules sécrétoires vers la membrane plasmique.
Le calcium se lie aux protéines de liaison au calcium sur la membrane granulaire sécrétoire.
De plus, les granules sécrétoires fusionnent avec la membrane plasmique médiée par des protéines liées à la membrane, entraînant une exocytose et la libération de contenus, y compris NPY-mRFP.
Après l’incubation, recueillir et transférer le surnageant contenant NPY-mRFP libéré dans une plaque noire à plusieurs puits.
Ajoutez un détergent non ionique pour lyser les cellules et libérer le NPY-mRFP intracellulaire restant.
Recueillir et transférer le lysat cellulaire dans la plaque multipuits.
À l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence, mesurez la fluorescence du surnageant cellulaire et du lysat pour
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques