Imagerie à super-résolution de la formation de synapses immunologiques de cellules NK sur une bicouche lipidique supportée

Préparez une lame de chambre avec une bicouche lipidique supportée, ou SLB, composée de phospholipides et de phospholipides biotinylés.

Ajoutez des protéines bloquantes pour éviter les interactions non spécifiques.

Introduire la streptavidine, qui se lie aux phospholipides biotinylés.

Ajoutez des anticorps anti-CD16 biotinylés marqués par fluorescence, qui se lient à la streptavidine immobilisée.

Pipette D-biotine pour empêcher la liaison non spécifique de la streptavidine aux cellules.

Introduisez des cellules tueuses naturelles, ou NK. Les récepteurs CD16 de ces cellules se lient spécifiquement aux anticorps anti-CD16 liés à la SLB, formant une synapse immunologique.

Cette liaison déclenche le réarrangement de l’actine et la polarisation des microtubules, formant finalement des micrograppes au centre de la synapse contenant des anticorps anti-CD16 liés à la SLB et des récepteurs CD16.

Les granules lytiques contenant de la perforine se polarisent et pénètrent à travers les filaments d’actine au niveau de la synapse.

Fixez les cellules. Perméabiliser les membranes et SLB.

Ajoutez des anticorps anti-phalloïdine et anti-perforine marqués par fluorescence, qui se lient respectivement aux filaments d’actine et à la perforine.

À l’aide d’un microscope à fluorescence à super-résolution, visualisez la distribution des filaments d’actine fluorescents et des granules positifs à la perforine au niveau de la synapse.

Pour assembler la bicouche lipidique planaire soutenue par du verre, préparez d’abord 100 millilitres de solution de piranha en mélangeant 30 % de peroxyde d’hydrogène avec de l’acide sulfurique dans un rapport de 1 à 3 dans un bécher. Dans cette solution, placez deux lamelles rectangulaires #1.5 pendant 20 à 30 minutes. Pendant que les lamelles sont nettoyées, récupérez un tube de lipides DOPC de 400 micromolaires préalablement préparés et un tube de lipides Biotin-PE de 80 micromolaires préalablement préparés. Transportez-les sur de la glace jusqu’à la cuve d’argon.

Après avoir désoxygéné un nouveau tube de microcentrifugation avec de l’argon, additionnez le DOPC et la Biotin-PE dans un rapport de 1 à 1. Le volume spécifique variera en fonction des besoins expérimentaux, mais devrait être, au minimum, de 2 microlitres chacun. Désoxygénez le tube de mélange et les tubes de réactifs individuels avant de les remettre au réfrigérateur.

Une fois le nettoyage terminé, rincez abondamment les lamelles à l’eau distillée. Mettez les lamelles à sécher à l’air libre pendant quelques minutes. Ensuite, prélevez 1,5 microlitre du mélange de liposomes et aliquotez-le en une seule goutte dans l’une des chambres de voie d’une lame de chambre. L’utilisation de deux chutes par voie est typique mais pas nécessaire.

Maintenant, placez rapidement et efficacement la lamelle sèche sur les gouttelettes. Assurez-vous que les gouttes sont suffisamment espacées pour qu’elles ne se confondent pas une fois la lamelle placée. De plus, assurez-vous que les gouttes restent circulaires et bien définies, sans toucher les bords des parois de la chambre. Appuyez fermement, entre et autour de chaque voie, pour assurer une étanchéité entre la lamelle et la glissière.

Marquez les positions des gouttes à l’aide d’un marqueur. Ensuite, passez 100 microlitres de caséine aqueuse à 5 % dans la chambre pour bloquer la bicouche. Essayez de vous assurer qu’il n’y a pas de bulles dans la chambre d’écoulement. Ensuite, injectez 100 microlitres de streptavidine à une concentration de 333 nanogrammes par millilitre dans chaque voie.

Après avoir incubé pendant 10 à 15 minutes à température ambiante, laver en faisant couler 3 millilitres de solution saline tamponnée HEPES avec 1 % d’albumine sérique humaine dans chaque voie pour éliminer l’excès de streptavidine. Ajouter 100 microlitres d’anti-CD16 biotinylé et marqué par fluorescence à la concentration protéique précédemment déterminée, comme décrit dans le protocole textuel.

Après l’incubation dans l’obscurité pendant 20 à 30 minutes, laver à nouveau en faisant couler 3 millilitres de solution saline tamponnée HEPES avec 1 % d’albumine sérique humaine dans chaque voie. Ensuite, faites couler 100 microlitres de D D-biotine à une concentration de 25 nanomolaires à travers la chambre afin de lier tout excès de streptavidine, et ainsi, d’éliminer le risque de liaison non spécifique de la streptavidine aux cellules.

Ensuite, comptez les cellules NK humaines et mettez-les en suspension à une concentration de 500 000 par millilitre dans une solution saline tamponnée à HEPES avec 1 % d’albumine sérique humaine. Lavez la D-biotine hors de la chambre avec 3 millilitres supplémentaires de solution saline tamponnée HEPES avec 1 % d’albumine sérique humaine par voie. Une fois que les cellules ont été remises en suspension à la concentration souhaitée, ajoutez 100 microlitres dans chaque voie. Placez la chambre dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 à 60 minutes.

Après cette période d’incubation, fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 10 à 20 minutes. Lavez en faisant couler 3 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate dans chaque voie pour éliminer le paraformaldéhyde. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de tampon de blocage avant d’incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, colorez l’actine F et la perforine en ajoutant 200 microlitres d’anticorps monoclonal anti-perforine dilué et marqué par fluorescence de phalloïdine et d’anticorps monoclonal anti-perforine marqué par fluorescence. Incuber à température ambiante pendant une heure avant de laver en faisant couler 3 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate dans la chambre. La chambre est prête pour l’imagerie.

Pour commencer, allumez tous les modules matériels nécessaires du microscope STED. Démarrez le logiciel d’analyse d’images et activez les modules de balayage résonant et STED. Après avoir effectué ces sélections, attendez environ trois à cinq minutes que le logiciel se lance.

Cliquez sur l’onglet Configuration en haut de l’écran. Sélectionnez Configuration laser. Ensuite, allumez la lumière blanche et les lasers STED 592 nanomètres. Choisissez l’objectif 100X et alignez le faisceau laser d’excitation avec un laser d’épuisement de 592 nanomètres. Sélectionnez le module Laser Config. Éteignez le laser d’appauvrissement 592 et allumez le laser d’appauvrissement de 660 nanomètres.

Placez la glissière sur la platine au-dessus de l’objectif. Mettez au point les cellules liées à la région bicouche délimitée à l’aide de la lampe à lumière blanche et des oculaires. Ensuite, retournez à l’onglet Acquisition directement à droite de l’onglet Configuration. Cliquez sur l’onglet Passer à la lumière blanche, puis activez ce module et faites glisser la ligne laser d’excitation sur la longueur d’onde appropriée.

Après avoir sélectionné le détecteur souhaité et réglé la plage de détection, cliquez sur le bouton Séquentiel dans la barre d’outils Acquisition de gauche pour afficher la boîte de dialogue de balayage séquentiel en bas de la barre d’outils de gauche. Cela permet à l’utilisateur d’ajouter plusieurs séquences, chacune avec un faisceau d’excitation différent pour une couleur différente. Cliquez entre les images, puis définissez la fréquence d’excitation, le détecteur et la plage de détection pour chaque couleur supplémentaire. Une fois tous les paramètres optimisés, appuyez sur Démarrer pour commencer le processus d’acquisition.