Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:10 min • July 8th, 2025
Prenez une plaque multi-puits contenant des tranches de poumon humaines coupées avec précision, qui maintiennent la microarchitecture pulmonaire native.
Retirez le support. Ajoutez des concentrations croissantes d’agent d’essai dans les puits et incuberez.
En fonction de son potentiel cytotoxique, l’agent testé perturbe les membranes cellulaires, induisant la mort cellulaire et réduisant les cellules viables à l’intérieur des tranches.
Après l’incubation, retirer le milieu. Immergez les tranches dans un milieu contenant du sel de tétrazolium soluble dans l’eau, ou WST-1, et un réactif de couplage d’électrons.
couver. Dans les cellules métaboliquement actives, le système de transport d’électrons de la membrane plasmique transfère les électrons du NADH intracellulaire au réactif de couplage d’électrons extracellulaire, réduisant le colorant imperméable aux cellules WST-1 en formazan stable, jaune foncé et soluble dans l’eau.
Après l’incubation, secouez la plaque pour répartir uniformément le formazan et transférez-le dans une plaque multi-puits.
À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’absorbance du formazan, indicateure de la viabilité des tissus.
Une diminution de l’absorbance du formazan, en fonction de la concentration de l’agent d’essai, indique une réduction de la viabilité de la tranche pulmonaire, confirmant la cytotoxicité de l’agent d’essai.
Pour préparer un mélange principal de la solution de travail, diluez 25 microlitres de réactif WST-1 et 225 microlitres de milieu pour chaque puits. Ensuite, pipetez 250 microlitres de la solution de travail master-mix de WST-1 pour chaque puits, et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure. S’assurer que les PCLS sont entièrement recouverts par le réactif WST-1 pendant l’incubation.
Ensuite, placez la plaque sur un agitateur orbital à 200 tr/min et agitez soigneusement pendant 30 secondes pour assurer un mélange complet du réactif WST-1. Ensuite, pipetez 100 microlitres de surnageant de chaque puits de la plaque de 24 puits vers une nouvelle plaque à fond plat de 96 puits en doublets. Mesurez l’absorption de chaque puits à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques, et soustrayez l’absorption à 630 nanomètres de référence de celle à 450 nanomètres.