Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 2:58 min • July 8th, 2025
Commençons par des tranches de poumon humaines découpées avec précision, traitées avec des agents cytotoxiques comme des molécules de tensioactif dans une plaque multipuits.
Le tensioactif s’insère dans la bicouche lipidique de la cellule, provoquant l’interaction des queues hydrophobes du tensioactif avec le noyau hydrophobe de la bicouche lipidique.
Par conséquent, l’arrangement ordonné des molécules lipidiques est perturbé, conduisant à la formation d’une micelle.
Cela compromet l’intégrité de la membrane, provoquant la fuite de contenu intracellulaire, y compris la lactate déshydrogénase ou LDH, un indicateur courant de dommages à la membrane cellulaire.
Récupérez le surnageant contenant la LDH libérée.
Ajouter le cocktail de réaction du test LDH contenant du substrat de lactate, du NAD+, de la diaphorase et du sel de tétrazolium, et incuber.
La LDH oxyde le lactate en pyruvate, avec réduction simultanée de la coenzyme NAD+ en NADH.
La diaphorase utilise le NADH pour réduire le sel de tétrazolium en formazan - un produit coloré.
La cytotoxicité induite par le tensioactif peut être mesurée à partir de l’activité de la LDH indiquée par la production de formazan.
Après avoir incubé le PCLS avec ou sans agents d’essai, transférez 50 microlitres de surnageant et de duplicatas dans une nouvelle plaque à 96 puits. Cela génère des doublons à partir de chaque puits traité d’une plaque de 24 puits.
Immédiatement avant le dosage, préparez un master-mix de la solution de travail du réactif LDH en mélangeant soigneusement 125 microlitres de solution catalytique avec 6,25 millilitres de solution de colorant pour une plaque à 96 puits. Ensuite, pipetez 50 microlitres de la solution de travail master-mix dans chaque puits contenant déjà 50 microlitres de surnageant, et incubez la plaque pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, mesurez l’absorption de chaque puits à 492 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques, et soustrayez l’absorption à 630 nanomètres de référence de celle à 492 nanomètres.