Une technique in vitro pour visualiser l’exocytose des granules sécrétoires dans les mastocytes

Prenez un verre de protection chambré contenant des mastocytes – des cellules immunitaires avec des granules sécrétoires, ou SG, contenant des médiateurs inflammatoires.

Ajoutez des anticorps IgE avec un rapporteur fluorescent sensible au pH et incuber.

Les anticorps se lient aux récepteurs Fc des mastocytes. Les rapporteurs sont internalisés par pinocytose, et les endosomes qui en résultent fusionnent avec les SG.

Retirez le support. Ajouter un antigène contenant plusieurs épitopes de liaison aux IgE ; Placez la lame sous un microscope à fluorescence et appliquez la longueur d’onde d’excitation requise.

Le pH acide des SG éteint la fluorescence du rapporteur.

L’antigène se lie aux complexes de récepteurs IgE à la surface de la cellule, les réticulant.

L’agrégation des récepteurs médiée par l’antigène déclenche la migration des SG vers la membrane plasmique.

Les

protéines SNARE sur le plasma et la membrane SG médient la fusion membranaire et la décharge de la cargaison SG, appelée exocytose.

Le pH plus élevé du milieu provoque l’alcalinisation SG, induisant les rapporteurs à retrouver la fluorescence.

Les SG entrants fusionnent avec les systèmes à membrane fusionnée. L’alcalinisation du second SG médie la récupération de la fluorescence, confirmant l’exocytose du composé.

Ajoutez 10 microlitres de suspension cellulaire dans un verre de protection chambré avec un milieu de culture frais enrichi en FITC-dextran, et cultivez les cellules RBL pendant la nuit. Tout d’abord, préparez une solution tampon finale de Tyrode selon le protocole texte. Ensuite, préparez un réactif de sécrétagogue 20x dans le tampon fraîchement préparé.

Dissoudre la poudre de chlorure d’ammonium dans le tampon de Tyrode pour créer une solution de chlorure d’ammonium de 400 millimolaires. Ensuite, aspirez le support du verre de protection chambré et remplacez-le par 300 microlitres de tampon Tyrode préchauffé. Après avoir répété le processus de lavage deux fois, remplissez la chambre avec 300 microlitres de tampon Tyrode.

Ensuite, placez le verre de protection dans la chambre d’incubation d’un microscope et assurez-vous que la chambre est stable. Allumez la source de lumière fluorescente et sélectionnez le filtre de fluorescence approprié. Une fois que la zone d’intérêt est nette au milieu du champ de vision, éteignez la source lumineuse.

Ensuite, allumez le laser de 488 nanomètres avec l’émission recueillie autour de 500 à 550 nanomètres. Ensuite, calibrez l’intervalle de temps entre les acquisitions d’images. Réglez la direction de balayage sur « Bidirectionnel ». Ne pas permettre le calcul de la moyenne. Ouvrez le sténopé et réglez la résolution sur 512 par 512.

Ensuite, imagez les cellules pendant la durée appropriée pour le type de cellule ou le sécrétagogue spécifique. Ensuite, ajoutez 16 microlitres de la solution sécrétagogue dans la chambre et continuez à filmer. Enfin, pour confirmer la présence et la localisation de FITC-dextran dans les granules sécrétoires, ajoutez doucement 16 microlitres de solution de chlorure d’ammonium dans la chambre.