JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 2:49 min • July 8th, 2025
Prenez un dispositif de filtration centrifuge de grand volume contenant des membranes verticales de cellulose régénérée d’une taille de pores appropriée.
Ajouter le tampon et la centrifugeuse. Retirez l’humectant membranaire contenant l’écoulement continu.
Chargez l’appareil avec de la protéine de filtrat de culture bactérienne, ou CFP, englobant des protéines solubles et des vésicules extracellulaires, ou EV – des structures nanométriques liées aux lipides contenant des biomolécules sécrétées par les bactéries.
Lors de la centrifugation, le CFP passe tangentiellement à travers les membranes par la force centrifuge.
Les biomolécules plus petites que les pores de la membrane passent à travers le liquide de culture, tandis que les plus grandes, telles que les VE, passent sur la surface de la membrane, minimisant ainsi le colmatage de la membrane.
Le filtre concentre le CFP dans un volume minimum de l’appareil, aidé par son volume d’arrêt pour empêcher le dessèchement des biomolécules.
Ajouter le tampon et la centrifugeuse.
Le tampon remplace les composants résiduels du milieu, créant un environnement isotonique pour les biomolécules de CFP et préservant leur intégrité.
Placez le gobelet à concentré sur le gobelet du filtre, retournez-le et centrifugez-le. Récupérer le rétentat concentré de CFP pour une analyse plus approfondie.
Pour commencer, préparez un filtre centrifuge de coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons en ajoutant la capacité volumique totale de PBS. Centrifugez pendant cinq minutes à 2 800 fois g à 4 degrés Celsius. Jetez le flux et tout PBS restant, et remplissez la chambre d’échantillonnage avec Mtb CFP jusqu’à sa capacité maximale. Centrifuger à 2 800 fois g à 4 degrés Celsius jusqu’à ce que le volume soit réduit au volume minimum de l’appareil d’ultrafiltration. Répétez l’opération si nécessaire jusqu’à ce que l’échantillon entier ait été suffisamment réduit.
Ajoutez 1x PBS à l’unité de filtration contenant le concentré jusqu’à la capacité totale de l’appareil. Réduisez le volume comme décrit précédemment et répétez cette étape cinq fois pour assurer un lavage et un remplacement complets de la mémoire tampon. Ensuite, récupérez le rétentat CFP concentré de 100 kilodaltons, ou 100R, selon les spécifications du dispositif d’ultrafiltration. Lavez le filtre avec un volume minimal de 1x PBS au moins trois fois, et tirez le lavage avec le 100R pour maximiser la récupération.