Une technique pour quantifier l’infection fongique chez les larves de poisson-zèbre

Prenez une larve de poisson-zèbre à laquelle on a injecté des spores fongiques dans le ventricule du cerveau postérieur.

Les macrophages sont recrutés au site d’injection, formant un amas serré autour des spores.

Les spores subissent un engloutissement phagocytaire par les macrophages.

Ces spores ont la capacité de résister à la dégradation à l’intérieur du phagosome, ce qui leur permet de germer en hyphes et d’induire la mort cellulaire nécrotique du macrophage.

Les hyphes possèdent des motifs moléculaires associés à des agents pathogènes exposés, ou PAMP, à leur surface.

Les neutrophiles recrutés sur le site de l’infection reconnaissent et lient les PAMP. Le contact avec les neutrophiles déclenche un phénotype hyper-ramifié complexe chez les hyphes, empêchant ainsi leur absorption par les neutrophiles et facilitant l’évasion immunitaire.

Homogénéiser la larve, en libérant les spores fongiques viables et les hyphes. Centrifuger pour éliminer les débris cellulaires et déposer le surnageant sur un milieu de croissance.

Lors de l’incubation, comptez les unités fongiques formant des colonies ou UFC.

Le nombre d’UFC représente le nombre de spores fongiques viables qui ont échappé aux défenses immunitaires de l’hôte.

Immédiatement après l’injection, transférez huit des larves dans des tubes individuels de 1,7 millilitre et euthanasiez-les. Préparez 1 millilitre de PBS avec de l’ampicilline et de la kanamycine. Retirez autant de liquide que possible des tubes contenant les larves. Ensuite, ajoutez 90 microlitres de PBS avec des antibiotiques.

Homogénéiser les larves dans un lyseur tissulaire à 1 800 oscillations par minute pendant 6 minutes. Ensuite, faites-les tourner à 17 000 fois g pendant 30 secondes. Pipetez la suspension homogénéisée de chaque tube jusqu’au milieu d’une plaque GMM étiquetée, et étalez-la à l’aide d’un écarteur jetable en forme de L, en prenant soin de ne pas l’étaler contre le bord. Incuber les assiettes à l’envers à 37 degrés Celsius pendant 2 à 3 jours. Ensuite, comptez le nombre de colonies formées.