Une technique zWEDGI pour visualiser les larves de poisson-zèbre infectées par des agents pathogènes fongiques

Commencez par des larves de poisson-zèbre transgéniques exprimant des cellules immunitaires marquées par fluorescence marquées avec des marqueurs fluorescents uniques pour un suivi précis.

Les larves sont pré-injectées avec une protéine fluorescente rouge exprimant les spores d’Aspergillus, dans leur cerveau postérieur.

Dans le cerveau postérieur, les spores fongiques imitent l’inflammation locale et attirent les cellules immunitaires, y compris les macrophages, qui phagocytent les spores pour leur élimination.

Tandis que quelques spores persistent et germent en hyphes, libérant des molécules dérivées d’agents pathogènes et attirant les neutrophiles vers le site d’infection.

Transférez une larve anesthésiée dans la chambre de chargement contenant le milieu du dispositif de blessure et de piégeage du poisson-zèbre pour la croissance et l’imagerie, ou zWEDGI, interconnecté à la chambre de blessure via un canal de restriction.

Fixez la larve dans le canal de restriction dans une orientation dorsale-latérale pour l’imagerie du cerveau postérieur.

Dans les premiers stades, la fluorescence rouge représente les spores fongiques, tandis que la fluorescence verte confirme le recrutement des macrophages sur le site de l’infection.

Au fil du temps, la propagation de la fluorescence rouge signifie la progression de l’infection, tandis que l’émergence d’une fluorescence bleue supplémentaire indique le recrutement des neutrophiles.

Le jour de l’imagerie, préparez une boîte de Pétri de 3,5 millimètres avec 100 micromolaires PTU et une avec de la E3-tricaïne. Ajoutez de l’E3-tricaïne dans les chambres d’un appareil zWEDGI et utilisez une micropipette P100 pour éliminer les bulles d’air des chambres et du canal de retenue, puis retirez tout l’excès d’E3-tricaïne à l’extérieur des chambres.

Pipetez une larve et transférez-la dans la boîte avec le PTU E3, puis transférez-la dans la tricaïne E3 avec le moins de liquide possible. Après 30 secondes, transférez les larves anesthésiées dans la chambre de chargement du dispositif de blessure et de piégeage.

Retirez l’E3-tricaïne de la chambre de blessure et libérez-la dans la chambre de chargement afin de déplacer la queue des larves dans le canal de restriction. Assurez-vous que la larve est positionnée sur son côté latéral, dorsal ou dorsolatéral afin que le cerveau postérieur puisse être imagé avec une lentille d’objectif inversée.

Après avoir imagé la larve à l’aide d’un microscope confocal, libérez de l’E3-tricaïne dans la chambre de blessure pour pousser la larve du canal de retenue dans la chambre de chargement. Ramassez la larve et transférez-la dans la boîte avec de la tricaïne E3, puis transférez-la dans la boîte avec de la PTU E3 avec le moins de liquide possible. Rincez-le au PTU et transférez-le dans la plaque à 48 puits.