Dosage de l’opsono-adhérence pour évaluer l’opsonisation de bactéries encapsulées par des anticorps anti-capsule

Prenez une suspension de Bacillus anthracis, chimiquement tué et marqué par fluorescence.

La capsule bactérienne, principalement composée d’acide poly-gamma-glutamique, offre une protection contre la phagocytose.

Prenez des sérums de primates non humains, inactivés par la chaleur pour détruire les protéines du complément. Ces sérums, isolés d’animaux immunisés avec un vaccin à base de capsules bactériennes, contiennent des anticorps anti-capsules.

Ajoutez la suspension bactérienne tuée chimiquement dans le sérum. Les anticorps se lient spécifiquement aux capsules bactériennes, facilitant l’opsonisation bactérienne et les marquant pour leur élimination par les cellules phagocytaires. Ajouter des protéines standard du complément pour améliorer l’opsonisation.

Transférez les bactéries opsonisées dans des macrophages adhérents – des cellules phagocytaires. Incuber brièvement.

Les anticorps et les protéines du complément de la bactérie se lient respectivement aux récepteurs Fc des macrophages et aux récepteurs du complément, favorisant ainsi l’adhésion bactérienne.

Retirez le support. Laver avec un tampon pour éliminer les bactéries non adhérentes.

Fixez les cellules pour préserver l’intégrité cellulaire.

Utilisez un colorant fluorescent pour marquer les macrophages.

À l’aide d’un microscope à fluorescence, observez les bactéries fluorescentes adhérant à des macrophages différemment fluorescents, confirmant l’efficacité de l’opsonisation bactérienne par les anticorps anti-capsule.

Lavez le stock bactérien inactivé trois fois dans du PBS pour éliminer le fixateur. Ajouter la solution FITC à une concentration finale de 75 microgrammes par millilitre. Lentement, agitez le mélange pendant 18 à 24 heures à quatre degrés Celsius. Lavez les bactéries comme avant pour éliminer l’excès de FITC.

Après le dernier lavage, remettez les bacilles en suspension dans PBS dans le même volume de départ. Aliquote et conservez les bacilles à -20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Inactiver par la chaleur un petit volume de sérums de test provenant de primates non humains à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes, dans un bloc de chaleur ou une machine PCR. Décongelez et lavez deux fois les bactéries marquées au FITC avec du PBS en les granulant à 15 000 g pendant trois à cinq minutes. Suspendez à nouveau dans PBS dans le même volume de démarrage.

Dans une plaque à fond rond de 96 puits, diluer en série les sérums d’essai dans un milieu cellulaire. Dans une autre plaque à fond rond de 96 puits, ajoutez 10 microlitres de sérum de test dilué dans chaque puits. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de complément de bébé lapin fraîchement reconstitué.

À la plaque numéro trois, ajoutez le volume approprié de bacilles marqués FITC pour une multiplicité d’infection de 20, par exemple, à un volume contenant 50 000 fois 20 bacilles pour 50 000 cellules. Remplissez chaque puits de la plaque numéro trois avec le volume approprié de milieu cellulaire jusqu’à un total de 105 microlitres. Incuber la plaque numéro trois à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en présence de 5 % de CO2 avec de l’humidité pour opsoniser les bacilles.

Placez la plaque numéro un qui contient des cellules adhérentes sur un bloc de chaleur de 37 degrés Celsius. Utilisez une pipette multicanaux pour retirer le fluide usé des puits et remplacez-le rapidement par 100 microlitres de bactéries opsonisées de la plaque numéro trois, en veillant à ce qu’aucune bulle ne soit générée dans les puits pendant le pipetage. Pour ne pas perturber la monocouche cellulaire, ajoutez du volume sur les côtés des puits.

Incuber la plaque numéro un à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO₂ et d’humidité pendant 30 minutes pour l’adhérence. Lavez chaque puits cinq fois avec 150 microlitres de PBS sur un bloc chauffant de 37 degrés Celsius pour éliminer les bacilles non attachés. Pipette sur le côté des puits pour s’assurer que les cellules ne sont pas dispersées accidentellement pendant le lavage. Ajoutez 150 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits et fixez les cellules pendant une heure.

Après avoir lavé les cellules deux fois avec du PBS, mélangez deux microlitres de coloration orange de dépistage à haut contenu dans 10 millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de cette solution de coloration aux cellules fixes et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Placez la plaque numéro un sur la scène et concentrez-vous sur les cellules en utilisant le fond clair ou le contraste de phase.

Dans l’onglet Acquisition, sélectionnez le format 96-Well comme réglage de la plaque, puis sélectionnez Paramètres de canal. Ensuite, sélectionnez Réglage en mode mosaïque. Indiquez le nombre d’images à acquérir. Passez du mode d’acquisition en noir et blanc ou en monochrome et réglez le binning sur au moins 2 par 2. Activez l’autofocus ou le module de mise au point. Indiquez la fréquence à laquelle la fonction de mise au point automatique doit être effectuée.

Ensuite, activez la fonction z-stack si elle est disponible et indiquez le nombre de z-stacks qui captureront l’épaisseur de la monocouche cellulaire et des bacilles adhérents. Désignez un dossier de fichiers dans lequel enregistrer les images. Maintenant, exécutez le programme d’imagerie automatisé. Effectuer la collecte et l’analyse des données, comme décrit dans le protocole texte.