Évaluation de l’activation contrôlée des lymphocytes T avec un CMH peptidique photoactivable

Commencez par enduire un verre de protection avec de la poly-L-lysine biotinylée pour créer une surface riche en biotine.

Ensuite, introduisez la streptavidine – une protéine qui se lie à la biotine, formant un pont moléculaire pour les interactions ultérieures.

Ensuite, ajoutez des peptides photocages biotinylés liés à des complexes d’histocompatibilité majeurs (pMHC) ainsi que des molécules d’adhésion.

Les ligands biotinylés du pMHC et les molécules d’adhésion interagissent avec des régions spécifiques de la streptavidine, permettant leur immobilisation.

Ensuite, lavez le verre de couverture avec une solution saline tamponnée à plusieurs reprises et introduisez les lymphocytes T.

La présence d’une photocage, un groupe chimique sensible à la lumière attaché à un résidu spécifique sur le peptide, entrave la liaison spontanée du récepteur des lymphocytes T au peptide.

Pour une activation contrôlée des lymphocytes T, exposez les peptides photocages à la lumière ultraviolette.

La lumière UV rompt la liaison chimique entre le complexe photocage-peptide, exposant la forme native du peptide.

Les récepteurs des lymphocytes T identifient et se fixent aux peptides exposés, tandis que les intégrines se lient aux molécules d’adhésion, déclenchant l’activation des lymphocytes T.

Commencez par ajouter de la poly-L-lysine biotinylée ou de la bio-PLL diluée de 1 à 500 dans de l’eau distillée déminéralisée dans 8 verres de couverture à 8 puits compartimentés. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, laver à l’eau distillée déminéralisée, puis sécher pendant deux heures à température ambiante.

Bloquez les surfaces revêtues de bio-PLL avec un tampon de blocage composé d’une solution saline tamponnée HEPES avec 2 % de BSA pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, retirez le tampon de blocage des surfaces revêtues de bio-PLL sans laisser les puits sécher. Ensuite, ajoutez de la streptavidine et incubez à 4 degrés Celsius.

Au bout d’une heure, lavez les surfaces revêtues de HBS. Remplissez et retournez les puits de la chambre 4 à 5 fois, en retirant le HBS des puits. Ne laissez pas les puits sécher.

Ajoutez les ligands du peptide majeur d’histocompatibilité majeur d’histocompatibilité biotinylés spécifiques et les molécules d’adhésion des lymphocytes T CD4 positifs ou CD8 positifs aux surfaces recouvertes de bio-PLL. Protéger de la lumière et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Après l’incubation, laver comme précédemment et laisser dans HBS jusqu’au moment de semer. Enfin, ajoutez 200 000 lymphocytes T CD4 positifs ou CD8 positifs, en exprimant le TCR approprié dans les puits appropriés, et laissez les cellules adhérer à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Une fois que les cellules se sont fixées et se sont répandues à la surface, elles sont prêtes pour la photoactivation et l’imagerie. Utilisez un microscope à fluorescence à réflexion interne totale inversée équipé d’un objectif 150x compatible UV pour l’acquisition d’images. Surveillez les sondes dans les canaux vert et rouge à l’aide de lasers d’excitation de 488 nanomètres et 561 nanomètres respectivement.

Après avoir monté la lame de chambre contenant les lymphocytes T, ajustez les paramètres du microscope pour obtenir un éclairage TIRF ou d’épifluorescence si nécessaire. En mode direct, sélectionnez un champ de cellules qui expriment les sondes fluorescentes d’intérêt. Établissez des régions à l’échelle du micron pour la photoactivation sous les cellules individuelles à l’aide d’un contrôle logiciel. Ensuite, lancez l’acquisition.

En règle générale, 80 points de temps sont acquis avec un intervalle de 5 secondes entre chacun. Cela laisse du temps pour des expositions séquentielles de 488 nanomètres et de 563 nanomètres dans le cas d’expériences bicolores. Ensuite, après avoir acquis 10 points temporels, photo-activez les régions sélectionnées en ouvrant l’obturateur numérique du diaphragme pendant 1 à 1,5 seconde. Une fois le time-lapse terminé, sélectionnez un nouveau champ de cellules et répétez le processus.