$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Prenez un mélange de différents ensembles de microsphères - ou de billes de polystyrène de la taille d’un micron.
Chaque ensemble est couplé à un antigène unique d’un agent pathogène environnemental et est marqué par fluorescence de manière unique.
Ajoutez le mélange dans une plaque filtrante contenant une membrane au fond.
Introduire de la salive humaine contenant des anticorps contre les agents pathogènes environnementaux, qui se lient à des antigènes apparentés sur les microsphères.
Éliminer les anticorps non liés par le vide. Les anticorps liés aux microsphères sont conservés en raison de la petite taille des pores de la membrane.
Ajoutez des anticorps secondaires biotinylés pour se lier aux anticorps liés à la microsphère. Retirez les anticorps non liés.
Ajoutez de la streptavidine conjuguée à un colorant rapporteur fluorescent, qui se lie à la biotine sur les anticorps secondaires.
Retirez le colorant non lié, remettez les microsphères en suspension et passez-les dans un analyseur d’immunodosage multiplex.
Un faisceau laser détecte la fluorescence de la microsphère, identifiant l’antigène, tandis qu’un autre faisceau détecte le signal rapporteur, confirmant la présence d’un anticorps lié.
Les anticorps spécifiques de l’antigène dans la salive indiquent une exposition antérieure aux agents pathogènes correspondants.
Après avoir remis en suspension les stocks de billes couplées à l’antigène par vortex et sonication pendant 20 secondes, diluez les stocks de billes couplés jusqu’à une concentration finale de 100 billes par microlitre de chaque ensemble unique de billes dans PBS plus BSA. Ensuite, préparez une dilution de 1 à 4 de la salive à température ambiante dans du PBS plus BSA dans une plaque à puits profond de 96 puits. Pré-mouiller une plaque filtrante avec 100 microlitres de tampon de lavage et aspirer le surnageant.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres de billes couplées à l’antigène et un volume égal de salive diluée à 95 puits de la plaque filtrante à 96 puits pour une dilution finale de un à huit. Dans le même temps, ajoutez 50 microlitres de billes couplées à l’antigène plus 50 microlitres de PBS plus BSA seul dans le puits de contrôle.
Incuber les billes dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure sur l’agitateur de microplaques à 500 tr/min. Ensuite, aspirez le surnageant et lavez les puits deux fois avec 100 microlitres de tampon de lavage. Après le deuxième lavage, mettez à nouveau les billes en suspension dans 50 microlitres de PBS plus BSA, diluez l’anticorps secondaire et ajoutez-en 50 microlitres dans chaque puits.
Après avoir mélangé le contenu du puits à l’aide d’une pipette multicanaux, incubez la plaque sur l’agitateur dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les puits deux fois avec 100 microlitres de tampon de lavage et remettez les billes en suspension dans 50 microlitres de PBS frais plus BSA.
Maintenant, diluez le rapporteur et ajoutez 50 microlitres dans chaque puits. Bien mélanger avec la pipette multicanaux. Après 30 minutes à température ambiante sur le shaker dans l’obscurité, lavez les puits deux fois comme indiqué. Ensuite, mettez les billes en suspension dans 100 microlitres de PBS plus BSA et évaluez les échantillons sur l’analyseur.