Un test d’immunofluorescence pour caractériser et quantifier les granules de stress chez les mammifères

Prenez une plaque multi-puits contenant des cellules d’ostéosarcome adhérentes sur des lamelles.

Ces cellules cancéreuses osseuses sont prétraitées avec un produit chimique induisant du stress, ce qui entraîne la formation de granules de stress.

Les granules de stress sont des organites cytoplasmiques sans membrane comprenant des ARNm non traduisants, de petites sous-unités ribosomiques, des protéines de liaison à l’ARN ou RBP, des facteurs liés à la traduction et des protéines de signalisation.

Jetez le support et lavez les cellules avec un tampon. Fixer les cellules pour préserver la morphologie cellulaire.

Perméabiliser les cellules pour accéder aux cibles intracellulaires. Ajoutez des protéines bloquantes pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Introduire des anticorps primaires qui se lient à des RBP spécifiques et à des facteurs liés à la traduction dans les granules de stress.

Incuber avec différents anticorps secondaires marqués au fluorophore et un colorant Hoechst.

Les anticorps secondaires se lient aux anticorps primaires liés aux protéines associées aux granules de stress, tandis que les molécules de Hoechst colorent l’ADN.

Montez les lamelles contenant les cellules à l’aide d’un support de montage.

À l’aide d’un microscope à fluorescence, observez les cellules pour visualiser et quantifier les granules de stress, qui apparaissent comme des foyers fluorescents caractérisés par la co-localisation des protéines associées.

Pour fixer les cellules, retirez le milieu des puits et lavez les cellules avec environ 250 microlitres de PBS. Ajoutez environ 250 microlitres d’une solution de paraformaldéhyde tamponnée à 4 % pour fixer les cellules, en vous assurant que le haut de la lamelle est complètement recouvert. Ensuite, laissez la plaque sur un banc à bascule à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, retirez et jetez correctement le paraformaldéhyde.

Ajoutez environ 250 microlitres de méthanol glacé pour perméabiliser et aplatir les cellules. Incuber la plaque pendant 5 minutes supplémentaires à température ambiante sur une bascule. Une fois la perméabilisation terminée, jetez le méthanol et bloquez les cellules en appliquant environ 250 microlitres d’un tampon de blocage pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, préparez la solution d’anticorps primaires en ajoutant 12 microlitres d’anticorps contre G3BP1, eIF4G et eIF3b à 3 millilitres de tampon de blocage.

Ajoutez 250 microlitres de la solution d’anticorps dans chaque puits de la plaque à 24 puits. Incuber la plaque sur une bascule pendant au moins 1 heure à température ambiante. Après 1 heure d’incubation, retirez la solution d’anticorps et lavez les cellules avec environ 250 microlitres de PBS pendant 5 minutes. Ensuite, ajoutez 12 microlitres d’anticorps anti-souris Cy2, anti-lapin Cy3 et anti-chèvre Cy5 avec 3 microlitres de colorant Hoechst à 3 millilitres de tampon de blocage pour préparer la solution d’anticorps secondaire.

Ajoutez 250 microlitres de la solution secondaire d’anticorps dans chaque puits et couvrez la plaque pour protéger les échantillons de la lumière. Incuber la plaque sur une bascule à température ambiante pendant 1 heure. Une fois l’incubation terminée, retirez la solution d’anticorps et lavez les cellules avec du PBS pendant 5 minutes. Chauffez le fluide de montage dans le bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour réduire la viscosité. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette prédécoupée de 200 microlitres, placez 25 microlitres du support de montage sur une lame de verre étiquetée.

À l’aide d’une pince fine, transférez la lamelle du puits à la lame, en inversant le haut de sorte que les cellules fassent face au support de montage. Utilisez un embout P200 propre pour appuyer sur la lamelle. Une fois que toutes les lamelles sont montées, retirez l’excédent de support de montage en appuyant fermement un mouchoir de laboratoire contre la lame. Ensuite, rincez la lame avec de l’eau et épongez-la immédiatement avec du tissu de laboratoire une fois de plus.