Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
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Décongelez les papiers-filtres contenant le liquide de muqueuse nasale absorbé sur de la glace pour éviter la dégradation de l’échantillon.
Le liquide comprend des médiateurs immunitaires, notamment des chimiokines et des cytokines.
Plongez les papiers filtres dans un tampon. Transférez le contenu dans des filtres tubulaires. Centrifugeuse pour éluer le liquide de la muqueuse du papier filtre.
Ajoutez l’extrait nasal filtré à la plaque de dosage avec un ensemble d’anticorps de capture spécifiques au médiateur.
Les médiateurs immunitaires se lient à leurs anticorps correspondants.
Introduire des anticorps de détection marqués avec un complexe de ruthénium, qui se lient à leurs médiateurs respectifs.
Ajoutez un tampon à base de tris contenant de la tripropylamine, ou TPA.
Lorsqu’un potentiel est appliqué à travers les électrodes, le complexe de ruthénium et le TPA subissent une oxydation.
Le radical TPA qui en résulte excite le complexe de ruthénium.
En revenant à son état fondamental, le complexe de ruthénium émet des photons.
L’intensité lumineuse mesurée est proportionnelle à la concentration de médiateurs immunitaires spécifiques dans le liquide de la muqueuse.
Pour quantifier les médiateurs immunitaires des voies respiratoires, placez jusqu’à 10 échantillons provenant d’un stockage à moins 80 degrés Celsius sur de la glace et notez leurs numéros d’identification. Lorsque les échantillons ont décongelé, plongez les deux papiers filtres par sujet dans 150 microlitres de tampon fraîchement préparé par papier filtre.
Complétez-le avec un comprimé complet d’inhibiteur de protéase pour 25 millilitres de solution mère tampon. Transférez les échantillons dans un agitateur à plaques à 400 tr/min pendant 5 minutes. Transférez le tampon et les papiers filtres dans les gobelets des filtres tubulaires en acétate de cellulose.
Centrifuger les échantillons pour recueillir l’extrait nasal filtré au fond des tubes de la microcentrifugation. Ensuite, retirez les gobelets et placez les tubes sur de la glace. Ensuite, transférez des aliquotes de 150 microlitres de l’extrait nasal dans des puits individuels de plaques de stockage à faible teneur en protéines, et stockez les plaques à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Ensuite, mesurez la concentration des médiateurs immunitaires nasaux d’intérêt par réseau multiplexé basé sur l’électrochimiluminescence à haute sensibilité, conformément aux protocoles de dosage standard.