Suivi de l’arrivée de protéines de surface marquées à la GFP dans le réseau trans-Golgi à l’aide de nanocorps fonctionnalisés
Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 5:00 min • July 8th, 2025
Commencez par des cellules cancéreuses privées de sulfate exprimant une protéine de surface marquée à la GFP.
Ajoutez du sulfate radiomarqué et des nanocorps anti-GFP modifiés - un anticorps à chaîne unique portant un motif de tyrosine-sulfatation, et incubez.
Les cellules privées de sulfate internalisent les sulfates radiomarqués, les incorporant dans des composants cellulaires.
Le nanocorps anti-GFP se lie à la protéine de surface marquée à la GFP et est endocytosé dans une vésicule. Cette vésicule transporte le complexe protéique nanocorps-surface le long de voies intracellulaires spécifiques, y compris le réseau trans-Golgi, ou TGN.
Au sein du TGN, la sulfotransférase en présence d’un substrat transfère un sulfate radioactif à des résidus de tyrosine spécifiques sur le nanocorps, le radiomarquant, le radiomarquant.
Lavez les cellules. Ensuite, lysez les cellules.
Centrifugez le lysat pour éliminer les gros débris cellulaires. Isolez les nanocorps à l’aide d’une méthode de purification à base de billes de nickel.
Chargez la fraction isolée sur un gel SDS-PAGE pour séparer le nanocorps radiomarqué en bandes distinctes.
Soumettre le gel à une autoradiographie.
L’autoradiographie r
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