Un test pour quantifier la phagocytose médiée par des anticorps d’érythrocytes infectés par des parasites

Prenez les érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum. Marquez l’ADN du parasite avec un colorant fluorescent pour la visualisation du parasite.

Incuber ces érythrocytes infectés par le parasite avec des sérums provenant d’individus exposés au paludisme. Ces cellules présentent à leur surface des antigènes parasitaires, qui se fixent aux anticorps IgG humains acquis naturellement dans les sérums, opsonisant les cellules pour la phagocytose.

Transférez les érythrocytes infectés par le parasite opsonisé dans une plaque multipuits recouverte de protéines contenant une suspension de monocytes d’origine humaine - ou cellules phagocytaires.

Pendant l’incubation, les récepteurs Fc-gamma des monocytes interagissent avec les érythrocytes opsonisés par les IgG, déclenchant l’engloutissement des érythrocytes dans les phagosomes.

Après l’incubation, centrifuger la plaque pour éviter d’autres interactions cellulaires et arrêter la phagocytose.

Jetez le surnageant. Traiter avec une solution de lyse de chlorure d’ammonium, en rompant sélectivement les érythrocytes infectés non phagocytés sans affecter les monocytes.

Ajoutez un tampon contenant du sérum pour arrêter le processus de lyse. Centrifugez et jetez le surnageant contenant des érythrocytes lysés.

Remettez les monocytes en suspension dans un tampon.

Effectuer une cytométrie en flux pour quantifier les monocytes qui présentent une fluorescence à partir des érythrocytes infectés par le parasite qu’ils contiennent, confirmant ainsi leur phagocytose médiée par les anticorps.

Ajuster la suspension d’érythrocytes infectés purifiés de 3,3 fois 10 à la puissance 7 cellules par millilitre dans un milieu de culture parasitaire contenant du bromure d’éthidium jusqu’à une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre. Ensuite, retirez la solution de blocage d’une plaque de 96 puits en la jetant dans un conteneur à déchets. Ensuite, retirez tout excès sur une serviette en papier et ajoutez 30 microlitres de suspension d’érythrocytes infectés au bromure d’éthidium dans tous les puits sauf un dans la moitié supérieure de l’assiette. Ajoutez 30 microlitres de milieu de culture parasitaire dans le puits vide et incubez la plaque pendant 10 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.

A la fin de l’incubation, ajouter 170 microlitres de milieu de culture parasitaire dans chaque puits, et sédimenter les érythrocytes infectés au fond de la plaque par centrifugation. Retirez le surnageant en jetant la plaque dans un conteneur à déchets, et lavez les érythrocytes infectés marqués au bromure d’éthidium deux fois de plus avec 200 microlitres de milieu de culture parasitaire par puits, comme nous venons de le démontrer.

Après le deuxième lavage, à l’aide d’une pipette multicanaux, retirer soigneusement tout le volume de surnageant de chaque puits, sans déranger les pastilles, et remettre en suspension les érythrocytes infectés marqués au bromure d’éthidium dans 30 microlitres de solution d’anticorps, y compris les témoins appropriés et les échantillons d’essai préalablement préparés dans un milieu de culture parasitaire. Ensuite, placez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes, à l’abri de la lumière.

Pendant que les érythrocytes infectés sont opsonisés, collectez les cellules THP-1 par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans 12 millilitres de milieu de culture cellulaire THP-1 frais préchauffé.

Après une deuxième centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 1 millilitre de milieu de culture cellulaire THP-1 pour le comptage, et ajuster la concentration cellulaire à 5 fois 10 à 5e cellules par millilitre dans le milieu de culture cellulaire THP-1. Retirez la solution bloquante de la deuxième plaque de 96 puits et ajoutez 100 microlitres de cellules THP-1 dans chaque puits. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire.

À la fin de l’incubation par opsonisation, ajoutez 170 microlitres de milieu de culture parasitaire dans chaque puits de la plaque d’opsonisation, et sédimentez les érythrocytes infectés au fond de la plaque par centrifugation. Laver les érythrocytes opsonisés et infectés deux fois avec 200 microlitres de milieu de culture parasitaire par puits à l’aide d’une pipette multicanaux pour retirer soigneusement le surnageant après le deuxième lavage.

Remettre en suspension les érythrocytes opsonisés et infectés dans 100 microlitres de milieu de culture cellulaire THP-1 préchauffé par puits, et transférer 50 microlitres de chaque suspension érythrocytaire opsonisée et infectée dans un puits correspondant dans la plaque de phagocytose. Lorsque toutes les cellules ont été ajoutées, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 40 minutes maximum, à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, stopper la phagocytose par centrifugation à 4 degrés Celsius. Retirez le surnageant et remettez les granulés en suspension avec 150 microlitres de solution de lyse de chlorure d’ammonium à température ambiante par puits. Après exactement trois minutes, ajoutez 100 microlitres de FBS glacé à 2 % dans du PBS pour arrêter la lyse, et sédimentez les cellules intactes par centrifugation.

Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de FBS frais glacé à 2 % dans PBS, par puits, par lavage. Après le lavage final, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de FBS frais glacé à 2 % dans du PBS par puits.

Pour l’acquisition et l’analyse de la cytométrie en flux, chargez immédiatement les cellules sur un cytomètre en flux et utilisez le graphique linéaire de diffusion latérale directe par rapport au graphique linéaire pour les puits sans érythrocytes infectés afin de bloquer les cellules THP-1. Acquérez 10 000 événements dans cette porte et utilisez les cellules THP-1 avec les érythrocytes infectés opsonisés avec un contrôle positif pour mettre en place un histogramme permettant de mesurer l’intensité de fluorescence du bromure d’éthidium.

Pour l’analyse, ouvrez le graphique linéaire de diffusion latérale directe par rapport au graphique linéaire pour les puits sans érythrocytes infectés, et dirigez les cellules THP-1. Ensuite, mettez en place une porte positive dans un histogramme FL3 et copiez ces portes sur tous les autres puits d’échantillonnage pour déterminer le pourcentage de cellules THP-1 positives au bromure d’éthidium.