Dosage in vitro de l’activité de la sérine protéase des neutrophiles à l’aide d’un rapporteur fluorescent

Prenez une microplaque contenant des protéases à sérine neutrophiles ou NSP. Ces enzymes solubles à activité protéolytique, sécrétées par les neutrophiles, fonctionnent dans les réponses inflammatoires.

Ajoutez des sondes rapporteures fluorescentes portant un motif de reconnaissance qui agit comme un site de clivage pour les NSP. Les sondes sont conjuguées à un fluorophore donneur et à un fluorophore accepteur.

Lors de l’excitation par une longueur d’onde spécifique, le fluorophore donneur émet de l’énergie. En raison de sa proximité avec le donneur, le fluorophore accepteur absorbe l’énergie et émet une fluorescence d’une longueur d’onde différente.

Détectez les signaux donneur et accepteur séparément et calculez le rapport donneur/accepteur pour évaluer l’activité NSP. Un faible rapport indique l’extinction de la fluorescence du donneur en l’absence de clivage de la sonde.

Les NSP reconnaissent et clivent le motif de reconnaissance sur les sondes, libérant ainsi l’accepteur.

La distance de l’accepteur permet l’émission de fluorescence à partir du fluorophore donneur, ce qui augmente le rapport donneur/accepteur. Un rapport élevé indique un clivage efficace de la sonde par les NSP.

Décongelez les enzymes sur de la glace et établissez une courbe standard enzymatique comme décrit dans le manuscrit du texte. Parallèlement à la préparation standard, diluer les échantillons d’expectorations dans un tampon d’activation. Sur le lecteur de plaques, réglez la longueur d’onde d’excitation de la sonde NE FRET NEmo-1 à 354 nanomètres et la longueur d’onde d’émission à 400 nanomètres pour le donneur et à 490 nanomètres pour l’accepteur.

Pour la sonde FRET CG sSAM, réglez la longueur d’onde d’excitation à 405 nanomètres et l’émission à 485 nanomètres pour le donneur et à 580 nanomètres pour l’accepteur. Ajoutez 40 microlitres d’échantillons, d’étalons ou de blancs dans les puits d’une plaque noire de 96 puits et ajoutez le mélange principal.

Démarrez le lecteur de plaques et enregistrez l’augmentation du rapport donneur/accepteur toutes les 60 à 90 secondes pendant au moins 20 minutes ou jusqu’à ce que l’augmentation du signal atteigne un plateau. Exportez les données et calculez le rapport donneur-accepteur en divisant la RFU donneur par la RFU accepteur pour chaque point temporel et échantillon. Ensuite, calculez la moyenne et l’écart type du rapport donneur/accepteur. Déterminez la pente dans la croissance linéaire de la variation du rapport donneur-accepteur.