Dosage in vitro de l’activité de la sérine protéase des neutrophiles à l’aide d’un rapporteur fluorescent

Prenez une microplaque contenant des protéases à sérine neutrophiles ou NSP. Ces enzymes solubles à activité protéolytique, sécrétées par les neutrophiles, fonctionnent dans les réponses inflammatoires.

Ajoutez des sondes rapporteures fluorescentes portant un motif de reconnaissance qui agit comme un site de clivage pour les NSP. Les sondes sont conjuguées à un fluorophore donneur et à un fluorophore accepteur.

Lors de l’excitation par une longueur d’onde spécifique, le fluorophore donneur émet de l’énergie. En raison de sa proximité avec le donneur, le fluorophore accepteur absorbe l’énergie et émet une fluorescence d’une longueur d’onde différente.

Détectez les signaux donneur et accepteur séparément et calculez le rapport donneur/accepteur pour évaluer l’activité NSP. Un faible rapport indique l’extinction de la fluorescence du donneur en l’absence de clivage de la sonde.

Les NSP reconnaissent et clivent le motif de reconnaissance sur les sondes, libérant ainsi l’accepteur.

La distance de l’accepteur permet l’émission de fluorescence à partir du fluorophore donneur, ce qui augmente le rapport donneur/accepteur. Un rapport élevé indique un clivage efficace de la sonde par les NSP