Méthode basée sur une puce microfluidique pour l’analyse rapide de la chimiotaxie des neutrophiles à l’aide de sang total

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 vues • 3:54 min • July 8th, 2025

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À un échantillon de sang total, ajoutez des complexes d’anticorps spécifiques dirigés contre les cellules sanguines, à l’exception des neutrophiles.

Ajoutez des particules magnétiques qui se lient aux cellules sanguines liées au complexe d’anticorps.

Transférez l’échantillon marqué immunomagnétiquement dans l’orifice de chargement cellulaire d’une puce microfluidique.

Fixez des disques magnétiques au port de chargement de la cellule.

Le champ magnétique attire les cellules marquées immunomagnétiquement, les piégeant contre les parois latérales du port.

Les neutrophiles, une fois démarqués, s’écoulent dans la puce et sont piégés dans la zone d’amarrage cellulaire.

Ajouter une solution chimioattractante marquée par fluorescence et un milieu de migration dans les réservoirs désignés. Les liquides s’écoulent à travers les canaux microfluidiques, formant un gradient de concentration.

Lorsque le chimioattractant se lie au récepteur des neutrophiles, il déclenche des changements intracellulaires, ce qui oblige les neutrophiles à réorganiser leur cytosquelette et à étendre les pseudopodes.

Ces pseudopodes agissent comme des pieds, propulsant les neutrophiles vers des concentrations plus élevées de chimioattractants - un processus appelé chimiotaxie.

Utiliser des techniques de microscopie appropriées pour surveiller la migration des neutrophiles en réponse au gradient de chimioattractant.

Retirez l’eau déminéralisée de l’appareil et ajoutez 100 microlitres de solution de fibronectine par la sortie. Attendez trois minutes pour vous assurer que tous les canaux sont remplis de solution de fibronectine. Ensuite, incubez l’appareil dans une boîte de Pétri couverte pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, retirez la solution de fibronectine de l’appareil et ajoutez 100 microlitres de milieu de migration à partir de la sortie. Encore une fois, attendez trois minutes pour vous assurer que tous les canaux sont remplis avec le support de migration. Incuber l’appareil pendant une autre heure à température ambiante, avant de l’utiliser dans l’expérience de chimiotaxie. Placez 10 microlitres de sang total dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 2 microlitres du cocktail d’anticorps dans deux microlitres de particules magnétiques provenant d’un kit d’isolement de neutrophiles, et mélangez doucement le tube afin de marquer magnétiquement les cellules marquées par des anticorps. Incuber le mélange d’étiquettes pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, fixez deux petits disques magnétiques sur les deux côtés du port de chargement de cellule de l’appareil. Aspirez le support de tous les ports de l’appareil. Ensuite, pipetez lentement deux microlitres du mélange sanguin marqué dans le dispositif microfluidique à partir de l’orifice de chargement de la cellule. Placez le dispositif microfluidique sur la platine du microscope à température contrôlée à 37 degrés Celsius. Attendez quelques minutes jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de neutrophiles soient piégés dans la zone d’amarrage cellulaire.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution chimioattractante dans un milieu de migration de 100 microlitres dans leurs réservoirs d’entrée désignés, à l’aide de deux pipettes. Cela générera un gradient de chimioattractant par mélange chimique continu basé sur le flux laminaire. Il peut s’agir de protéines recombinantes, telles que la FMLP, ou d’échantillons cliniques, tels que le surnageant d’expectorations de patients atteints de BPCO.

Une fois l’écoulement stabilisé, acquérez des images de fluorescence du gradient de dextran FITC dans le canal. Ensuite, incubez l’appareil sur la platine du microscope à température contrôlée ou dans un incubateur de culture cellulaire conventionnel pendant 15 minutes. Après l’incubation, imagez le canal de gradient, à l’aide d’un objectif 10 fois pour enregistrer les positions finales de la cellule pour l’analyse des données.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026