Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 5:04 min • July 8th, 2025
Prenez deux populations de lymphocytes T CD8+ : des lymphocytes T CD8+ effecteurs préactivés par l’engagement des lymphocytes T et des récepteurs co-stimulateurs médiés par des anticorps et des lymphocytes T CD8+ supprimés inhibés par des cellules suppressives dérivées de myéloïdes.
Ajoutez ces lymphocytes T dans des puits recouverts d’une membrane basale avec des cellules cancéreuses exprimant une protéine fluorescente restreinte au nucléaire.
Pipetez un substrat fluorogène de la caspase-3 - un colorant fluorogène de liaison à l’ADN conjugué à un peptide contenant un site de reconnaissance de la caspase-3.
couver. Les récepteurs effecteurs des lymphocytes T se lient au complexe peptidique CMH de classe I sur les cellules cancéreuses, déclenchant la libération de granules cytotoxiques contenant des perforines et des granzymes.
Les perforines créent des pores de membrane cellulaire cancéreuse, permettant l’entrée de granzyme et l’activation des caspases, initiant l’apoptose.
Les caspases activées clivent en outre le substrat fluorogène de la caspase, libérant le colorant qui se lie à l’ADN et devient fluorescent.
Au microscope à fluorescence, les cellules cancéreuses co-cultivées avec des cellules T effectrices présentent une double fluorescence nucléaire, indiquant l’apoptose des cellules cancéreuses.
En revanche, les cellules cancéreuses co-cultivées avec des cellules T supprimées ne présentent que la fluorescence des protéines nucléaires, ce qui suggère des cellules non apoptotiques.
Pour mettre en place une co-culture de cellules T CD8 positives pré-activées, il faut d’abord ajouter 30 microlitres de matrice de membrane basale soluble à facteur de croissance réduit de 1 à 100 dilués dans les puits appropriés d’une plaque à fond plat de 96 puits adaptée à la microscopie. Secouez la plaque pour répartir uniformément la matrice et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au moins une heure. Pendant que la plaque s’équilibre, préparez les cellules cibles. Aspirez le milieu, lavez-le avec du PBS et ajoutez 1 millilitre de trypsine-EDTA à 0,05 % à température ambiante pendant 1 minute.
Ajoutez 9 millilitres de DMEM complété par du sérum de veau fœtal par pipetage doux, et transférez les cellules dissociées dans des tubes. Après centrifugation des cellules, remettre le granulé en suspension dans 500 microlitres d’EDMEM. Filtrez les cellules remises en suspension à travers une crépine et comptez les cellules vivantes. Ensuite, ajustez la densité à 4 fois 10 à la quatrième cellule cible par millilitre dans de l’EDMEM frais sur glace.
Ensuite, pipetez les lymphocytes T CD8 positifs pré-activés plusieurs fois pour les remettre en suspension dans une suspension unicellulaire, puis transférez les lymphocytes T flottants dans un tube de 1,5 millilitre par condition. Récupérez toutes les cellules restantes avec 200 microlitres de PBS par puits, transférez les lavages dans les tubes appropriés de 1,5 millilitre et centrifugez. Aspirez le fluide et ajoutez 1 millilitre d’EDMEM dans chaque tube pour la centrifugation.
Après centrifugation, remettre les granulés en suspension dans 100 microlitres d’EDMEM frais par tube. Après avoir compté, ajustez les cellules de chaque tube à une densité de 1,6 fois 10 puissance cinq cellules T CD8 positives préactivées par millilitre de milieu, et placez les cellules sur de la glace. Lorsque les cellules sont prêtes, aspirez la matrice de la membrane basale de chaque puits de la plaque de microscopie à 96 puits et ajoutez 50 microlitres de cellules cibles à des puits individuels à l’intérieur des 60 puits intérieurs de la plaque avec mélange.
Ajouter 25 microlitres d’EDMEM complétés par 4 fois 10 à la troisième unité par millilitre d’IL-2, et 10 substrats fluorogéniques micromolaires de caspase-3 dans les puits appropriés. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de lymphocytes T CD8 positifs pré-activés dans les puits appropriés, et enfin, ajoutez EDMEM dans les puits appropriés pour obtenir un volume total allant jusqu’à 100 microlitres. Ajoutez 200 microlitres de PBS ou d’eau stérile dans tous les puits vides, secouez la plaque et laissez-la sur une surface plane pendant 10 minutes.
Pour imager les cellules, réglez le microscope pour qu’il acquière des images en contraste de phase, ainsi que des canaux fluorescents adaptés à la protéine fluorescente restreinte au nucléaire et aux fluorophores du substrat fluorogène de la caspase-3 activée utilisée dans l’expérience. Ensuite, capturez des images de chaque puits expérimental en contraste de phase, et des deux canaux fluorescents toutes les une à trois heures pendant au moins 72 heures.