Un test de microneutralisation pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants dans le sérum humain

Pour un test de microneutralisation, prendre une plaque multipuits contenant du sérum humain inactivé par la chaleur et dilué en série avec des concentrations décroissantes d’anticorps neutralisants spécifiques de la grippe.

Introduire des virus grippaux pathogènes. Les anticorps sériques interagissent avec les virus et les neutralisent ; Cependant, des dilutions sériques plus élevées montrent une neutralisation limitée du virus.

Grainez avec des cellules rénales canines de Madine-Darby, ou cellules MDCK, surexprimant les résidus d’acide sialique humain à leur surface.

Dans la dilution plus élevée, les virus grippaux non neutralisés fusionnent avec l’acide sialique des cellules, libérant le génome viral dans le cytoplasme cellulaire.

Les gènes viraux sont transcrits et traduits en protéines virales et en nucléoprotéines au sein de la cellule hôte.

Traiter avec une forte concentration d’acétone pour la fixation et la perméabilisation.

Introduire des anticorps primaires qui interagissent avec les nucléoprotéines virales.

Superposition avec des anticorps secondaires conjugués à des enzymes qui interagissent avec les anticorps primaires. Laver et traiter avec le substrat de l’enzyme, produisant un produit colorant.

Quantifiez les intensités de couleur et comparez-les à la dilution sérique ; la dilution sérique la plus élevée, atteignant cinquante pour cent de neutralisation du virus, représente le titre de neutralisation.

Le jour 1 du test MN, décongelez les sérums dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius et retirez-les immédiatement après la décongélation. Inactiver la chaleur du sérum humain pendant 30 minutes dans un bain d’eau à 56 degrés Celsius, comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, placez le sérum sur de la glace et ajoutez le diluant viral au sérum pour obtenir une pré-dilution de 1 à 10.

Pour tester avec un virus, ajoutez 50 microlitres de diluant viral aux rangées B à H, à l’exception des colonnes 11 et 12. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 1 sérum dilué sur 10 dans les colonnes A1 à A10. Effectuez une dilution en série en deux fois des rangées A à H et jetez les 50 derniers microlitres de la rangée H.

Pour le contrôle du virus, ajoutez 50 microlitres de diluant viral dans les puits A12, B12, C12 et D12. Pour le contrôle cellulaire, ajoutez 100 microlitres de diluant viral dans les puits E12, F12, G12 et H12. Pour les sérums témoins, ajouter 100 microlitres de sérums témoins dilués dans le puits A, colonne 11, et ajouter 50 microlitres de diluant viral dans les puits B11 à H11. Procéder à la dilution en série. Couvrez les plaques et incubez à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’ajout du virus.

Pour l’ajout de virus, diluez le virus à 100 TCID50 dans 50 microlitres avec un diluant viral. Ajouter 50 microlitres de virus dilué dans tous les puits, à l’exception de la colonne 11 sur les plaques de titrage arrière et des puits de contrôle des cellules E12, F12, G12 et H12 sur toutes les plaques. Ajouter 50 microlitres de diluant viral à tous les puits de la colonne 11. Ensuite, ajoutez 50 microlitres du virus à 100 TCID50 dans 50 microlitres dans le premier puits.

Ensuite, mélangez et transférez 50 microlitres dans des puits successifs pour effectuer des dilutions en deux séries. Changez les pointes de pipette entre les puits pour éviter la propagation du virus. Jetez 50 microlitres du puits H11, puis ajoutez 50 microlitres de diluant viral à la colonne 11 pour porter le volume final à 100 microlitres. Tapotez les plaques pour mélanger. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure avant d’effectuer l’ajout de cellules MDCK le premier jour et ELISA le deuxième jour comme précédemment.

Après avoir ajouté les anticorps primaires et secondaires, comme décrit dans le protocole de texte, effectuez l’ajout de substrat et la lecture de la plaque. Lavez les plaques cinq fois avec 300 microlitres de tampon de lavage et tapotez sur une lingette non pelucheuse. Ajoutez 100 microlitres de substrat OPD fraîchement préparé dans chaque puits. Ensuite, incubez les plaques à température ambiante jusqu’à ce que les puits de contrôle du virus atteignent une densité optique de 490 nanomètres entre 0,8 et 3, avec le contrôle cellulaire à un faible OD de fond inférieur à 0,2. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution d’arrêt à tous les puits.

Lire le diamètre extérieur des puits à 490 nanomètres, à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques. Enfin, déterminez le titre d’anticorps neutralisants de chaque échantillon de sérum, comme décrit dans le protocole textuel.