Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:42 min • July 8th, 2025
Prenez une microplaque contenant des segments de gaine uniformes coupés à partir de plants de riz et des disques de feuilles obtenus à partir de feuilles de riz.
Ajoutez de l’eau stérile et incubez pendant la nuit pour permettre la récupération du stress de la plaie.
Ajoutez un peptide immunogène dérivé de flagelles bactériens qui agit comme un motif moléculaire associé à un agent pathogène ou PAMP.
Les cellules végétales sur les bords coupés se lient aux PAMPs via des récepteurs de reconnaissance de formes.
La liaison déclenche la signalisation en aval, activant une enzyme localisée dans la membrane plasmique appelée homologue de l’éclatement oxydase respiratoire ou RBOH.
Le RBOH activé produit des espèces réactives de l’oxygène ou ROS dans l’apoplast - l’espace intercellulaire. Le ROS produit est converti en peroxyde d’hydrogène.
Ajoutez une enzyme peroxydase et un substrat chimiluminescent.
La peroxydase utilise le peroxyde d’hydrogène pour convertir le substrat en un état intermédiaire excité, qui libère de l’énergie sous forme de lumière et retourne à l’état fondamental.
Mesurez la luminescence dans les deux types de tissus pour détecter une forte augmentation immédiatement après le traitement PAMP, indiquant une explosion de ROS.
Coupez la gaine des plants de riz de 10 jours en segments de 3 millimètres avec une lame de rasoir tranchante ou une lame chirurgicale pour le prétraitement un jour avant le test ROS. Placez 5 segments de gaine dans un puits individuel d’une plaque de microtitration de 96 puits contenant 100 microlitres d’eau doublement distillée pendant 10 à 12 heures.
Coupez les disques foliaires des plants de riz âgés de quatre à six semaines à l’aide d’un poinçon de biopsie avec un piston. Coupez toujours les disques de feuilles du tiers médian de la deuxième feuille de la barre principale pour réduire la variation des données. Ensuite, placez un disque foliaire dans un puits individuel d’une plaque de microtitration de 96 puits contenant 100 microlitres d’eau doublement distillée pendant 10 à 12 heures pour le prétraitement. Gardez tous les disques de feuilles flottants et orientés vers le haut dans les puits d’une plaque de microtitration pour le prétraitement de l’eau afin d’éviter les variations associées au côté des feuilles.
Préparez la solution d’élicitation en combinant 9,4 ml de 50 micromolaires de tris-HCl, 400 microlitres de solution L-012, 100 microlitres de peroxydase de raifort et 100 microlitres de flg22. Ajouter 200 microlitres de solution d’élicitation dans les puits.
Démarrez le logiciel et cliquez sur le bouton Expériences pour créer un nouveau protocole ou utiliser un protocole existant. Cliquez sur Procédure dans la fenêtre contextuelle pour configurer la plaque et sélectionner les puits de la plaque à surveiller. Cliquez sur Démarrer cinétique et définissez la durée d’exécution sur 30 minutes ou plus, selon les exigences expérimentales. Sélectionnez l’intervalle minimum pour obtenir les lectures aussi souvent que possible, et pour le temps d’intégration, choisissez 1 seconde ou plus, en fonction de l’intensité du signal.
Cliquez sur Valider puis sur OK pour confirmer les paramètres. Cliquez ensuite sur Détecter une nouvelle plaque dans la fenêtre contextuelle et attendez que le logiciel vous invite à ouvrir la boîte de dialogue de la plaque de chargement. Retirez soigneusement l’eau bidistillée des puits contenant les tissus prétraités, en évitant tout dommage ou dessiccation des tissus. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 200 microlitres de la solution d’élicitation dans les puits contenant les tissus. Placez la plaque à tester sur le support et commencez la détection.